Uso de un fluorómetro de alta sensibilidad para cuantificación fiable de la biblioteca NGS

Desafortunadamente, una biblioteca NGS de baja entrada puede parecer lista para ser secuenciada cuando aún no hay suficiente cantidad de ADN utilizable para el siguiente paso. Un resultado de concentración incierto podría resultar en una dilución incorrecta o en un nuevo análisis innecesario en este punto. La pregunta más útil para un laboratorio de secuenciación será si su método de cuantificación proporcionaría un resultado fiable en los niveles de concentración que alcanzan sus bibliotecas.

En este artículo vamos a hablar sobre el fluorómetro QFluo-1 de Longlight. Se utiliza en el flujo de trabajo para obtener un valor de concentración de ácidos nucleicos antes de la preparación de la biblioteca y/o la decisión de normalización por parte del investigador.

Determinar para qué sirve la medición

Antes de evaluar un fluorómetro, primero determina su siguiente uso. ¿Se utiliza el resultado para determinar si una biblioteca requiere una concentración adicional, realizar una dilución o normalizar varias bibliotecas a una entrada común? Existen diferentes niveles de incertidumbre tolerancia en cada decisión.

Documenta el rango de concentraciones que normalmente se encuentran en tu laboratorio; esto debería incluir muestras cercanas al límite inferior del rango. Si solo se demuestra ADN limpio y bueno, no revelará mucho sobre las problemáticas bibliotecas que llevaron a la compra. Selecciona muestras representativas, establece criterios de aceptación antes de comparar los resultados.

Entiende Qué Medios de alta sensibilidad para QFluo-1

Un ensayo de fluorescencia implica un reactivo que se elige para emitir una señal de un objetivo, por ejemplo, ADN de doble hebra. Esa señal es leída por el fluorómetro y se utiliza una calibración específica del ensayo para informar de la concentración. La sensibilidad del instrumento por sí sola no determina el rendimiento de todos los ensayos de ADN, ARN o proteínas: el reactivo del ensayo forma parte de la medición.

Según Longlight, el QFluo-1 tiene una sensibilidad de 0,01 ng/μL para la detectabilidad del ADNd, y puede detectar muestras de 1 a 20 μl. También menciona en las especificaciones de su producto que puede calibrarse en dos puntos y que su tiempo de medición no supera los tres segundos por muestra. Utiliza esos números como las especificaciones a considerar al utilizar el ensayo y los tipos de muestra que utilizará tu laboratorio.

Selecciona el ensayo antes de interpretar el número

Un laboratorio podría determinar la cantidad tanto de ADNDd como de ARN y proteínas en un solo instrumento, pero no debe considerar ninguno de estos como una prueba intercambiable. Elige el ensayo adecuado para el analito y revisa su rango de trabajo, preparación de la muestra y estándares.

Al evaluar una biblioteca NGS, considera si un ensayo de ADNDDDD puede proporcionar la respuesta a la pregunta concreta de ese paso de control de calidad. Longlight's Kit de ensayo de cuantificación QF se introduce para la cuantificación selectiva tanto de unwound (dsDNA) como de (ARN), y se marca como compatible con QFluo-1. También se informa que QFluo-1 es un "sistema abierto" para varios ensayos de fluorescencia, aunque la idoneidad debe determinarse ensayo por ensayo.

Pequeño Muestras: Proteger durante la preparación

Las bibliotecas de baja entrada suelen contener cantidades limitadas de material, por lo que es importante minimizar el consumo de muestras durante la cuantificación. Determinar la cantidad de muestra necesaria para el ensayo y calcular la cantidad de muestra restante para el procesamiento posterior. La entrada de muestra especificada para el QFluo-1 es de 1 a 20 μL, lo que proporciona al laboratorio una variedad de opciones; sin embargo, también deben tenerse en cuenta la mezcla y los tubos del ensayo que se van a utilizar en el procedimiento.

Seguir el mismo orden de pipeteo, mezcla e incubación para los estándares y para las incógnitas. Comprueba el ajuste de los tubos al instrumento y obedece los procedimientos de manejo dados en el ensayo. Longlight proporciona un formato de tubo de 0,5 mL para QFluo-1 y también tiene Tubos de ensayo Qtube – Asegúrese de comprobar la combinación de tubo y reactivo en el método de ensayo previsto antes de su uso rutinario.

Comprobado Bajo Fin con muestras reales de laboratorio

Ninguna hoja de especificaciones puede decirte si la preparación de la biblioteca que deseas te dará resultados repetibles. Al evaluar, utiliza los estándares según las instrucciones del ensayo y luego las muestras que cubren el rango de muestras que utiliza tu laboratorio.

Añade varios, uno o más que alterarían una decisión en un flujo de trabajo cerca de la concentración más baja para la que lo haría.

Medir repeticiones, NO lecturas repetidas de un solo tubo. Esta distinción proporciona una indicación de las diferencias causadas por el pipeteo o la preparación de los reactivos. Anote cualquier muestra fuera del rango del ensayo; predetermina si se diluirán, reejecutarán o reportarán como < validadas.

Medida Velocidad a lo largo de todo el flujo de trabajo

Una lectura rápida de instrumentos no requiere un ensayo de unos segundos. Se deben establecer estándares y muestras y el reactivo utilizado puede necesitar incubarse. Diseño de rendimiento para todo el proceso, especialmente con un gran grupo de bibliotecas entrando al mismo tiempo.

El tiempo de lectura de QFluo-1, según Longlight, no supera los 3 segundos por muestra. Cronometra la preparación, calibración, lectura y registro del resultado para un ensayo de muestra. Esto te da una buena idea del ajuste del instrumento dentro del plan de control de calidad de tu laboratorio.

El Resultado se convierte en una Regla de Control de Calidad de Biblioteca.

La cuantificación basada en fluorescencia proporciona información sobre la concentración de ADN, pero no evalúa la distribución del tamaño de los fragmentos de la biblioteca ni distingue las bibliotecas de secuenciación completamente construidas de otras especies de ADN. Dependiendo del método de preparación de la biblioteca y la plataforma de secuenciación, pueden ser necesarios métodos adicionales de control de calidad, como el análisis de fragmentos o la cuantificación de bibliotecas basada en qPCR.

Añadir un documento para registrar el Método QFluo-1 Aprobado.

Una vez que la configuración QFluo-1 tiene éxito, observa la configuración QFluo-1, el ensayo seleccionado, el tipo de tubo, la preparación estándar y los criterios de aceptación estándar. Suma el volumen de la muestra utilizada y el informe de los resultados. Esto transforma una demostración exitosa en una herramienta que puede ser utilizada por una variedad de operadores de la misma manera.

Para solicitar un presupuesto o ensayo, por favor envíe a Longlight los analitos, el rango esperado de concentración, el número de muestras por día y el ensayo previsto. Solicite información sobre la configuración de QFluo-1 y los consumibles compatibles con el método propuesto a través de su Página de contacto.

Conclusión

La importancia de contar con un fluorómetro sensible en un laboratorio NGS es la decisión que pueden tomar a baja concentración. Evalúa QFluo-1 utilizando el ensayo adecuado, bibliotecas representativas y preparación de muestras repetibles. Cada resultado de concentración es entonces más fácil de actuar cuando se documenta en una regla de control de calidad.

Preguntas frecuentes

P1. En el flujo de trabajo de la librería NGS, ¿qué se mide con QFluo-1?

Se utiliza para medir la concentración del analito objetivo (por ejemplo, dsDNA) con un ensayo de fluorescencia adecuado. Elige el ensayo del material y la decisión de control de calidad en cuestión.

P2. ¿Es suficiente la sensibilidad mencionada para aprobar un método?

No. Evalúa muestras representativas de prueba cerca del límite de decisión y evalúa muestras repreparadas antes del uso rutinario.

P3. ¿Tres segundos de lectura significan que todo el ensayo dura tres segundos?

No. La preparación de muestras y estándar, cualquier incubación necesaria y el registro de resultados son laboriosos.

P4. ¿Por qué es importante probar preparaciones duplicadas en lugar de leer un tubo repetidamente?

Las preparaciones separadas muestran una diferencia en la preparación creada en el proceso de pipeteo y/o en el montaje del ensayo. Todas esas diferencias en el manejo no pueden discernirse en lecturas repetidas de un solo tubo.

P5. ¿Elimina un fluorómetro de alta sensibilidad la necesidad de calibración?
No. Sigue los requisitos de calibración y control de calidad del ensayo para mantener la fiabilidad de las mediciones.