Electroforesis en gel horizontal para ADN plasmídico: separando formas superenrolladas, cortadas y lineales

La electroforesis del ADN es un método ampliamente utilizado en biología molecular. Una de las aplicaciones para las que se requiere el mayor nivel de separación es la determinación de las tres principales formas topológicas del ADN plasmídico, que son las formas superenrolladas, las de corte (circulares abiertas) y las lineales. Mostraremos cómo el nuevo Sistema de Gel Horizontal HE-50 ofrece aislamiento de plásmidos y control de calidad que permite una mayor separación y reproducibilidad.

[Cinco consideraciones para el proceso de electroforesis en gel de ácidos nucleicos | Thermo Fisher Scientific - EE. UU.

Topología de plásmidos: tres formas

El ADN plasmídico no es uniforme y es una mezcla de tres isoformas topológicas. En el contexto del aislamiento, estas formas generarán diferentes tasas de migración durante la electroforesis del ADN.

• Forma superenrollada (SC): Los plásmidos superenrollados se consideran las especies migratorias más rápidas en un gel de agarosa.

• Forma cortada (circular abierta/OC): La disposición circular del ADN plasmidal que tiene una ruptura de cadena simple ahora está relajada y, por tanto, cortada. Debido a su mayor tamaño efectivo, esta isoforma migra más lentamente que el ADN superenrollado.

• Forma lineal: La ruptura de ambas cadenas covalentes del plásmido da lugar a ADN lineal. Esta forma de ADN plasmídico tiene una estructura en forma de varilla y su migración es más lenta que la superenrollada, pero más rápida que la de la herida.

Al analizar la calidad del ADN plasmídico utilizado para la fabricación de vacunas de plásmidos de ADN, las principales autoridades reguladoras exigen que la preparación consista en al menos el 80% del plásmido en forma superenrollada.

Importancia de la topología de plásmidos en la investigación y la biofarmacéutica

En el ADN plasmid, la forma de las isoformas afecta a varios factores en procesos relacionados con las vacunas:

• Transfección a células de mamíferos: La forma superenrollada del ADN plasmídico es la más eficaz en la transfección de células de mamíferos en comparación con las formas relajadas y lineales.

• Producción de vacunas de ARNm: La necesidad de plantillas de plásmidos lineales para la transcripción in vitro (IVT) conlleva contaminantes de plásmidos circulares abiertos, afectando el rendimiento y la consistencia.

• Fabricación de vectores de terapia génica: Los plásmidos superenrollados de alta calidad son esenciales para la producción de vectores adenoasociados (AAV).

• Monitorización de la estabilidad: Las condiciones de almacenamiento y la duración del almacenamiento afectan la estabilidad del plásmido a medida que aumenta la frecuencia de las formas cortadas o lineales.

Avances recientes en investigación en el análisis de ADN plasmídico

Dos de los estudios recientes destacan la importancia de la separación de alta resolución del ADN plasmídico:

1. Corte de plásmidos mediado por ZorE (2025)

Un estudio publicado en Nature Communications (marzo de 2025) se centró en los sistemas de defensa bacteriana y demostró el control sobre las topologías de los plásmidos. El grupo de investigación del Instituto Zorya describió una transformación lenta del ADN del plásmido pSG483 enroscado a sus formas cortadas y lineales por la proteína ZorE. Se observó que este fue un proceso gradual, y la transformación fue analizada cuantitativamente usando ImageJ para realizar un estudio densitométrico. Se observó que los plásmidos superenroscados fueron gradualmente cortados por ZorE (768 nM) tras 60 minutos de incubación a 37 °C.

[Raspado de plásmidos mediado por ZorE (2025)]

*"La reacción se detuvo añadiendo EDTA y SDS, y los productos se separaron mediante electroforesis en gel en un tampón de 1× TAE, gel de agarosa al 1,4% y se tinturaron después con EB."* — Nature Communications, 2025

Este descubrimiento resultó ser fundamental respecto a los estudios de interacción entre fragmentos de ADN y proteínas realizados utilizando sistemas de gel.

2. ADN no B y proteínas de reparación del ADN (2025)

Una publicación de PNAS del NIH en enero de 2025 demostró que la inserción de repeticiones de dinucleótidos en plásmidos pUC18 tenía un efecto cis en la unión de proteínas de reparación de desajustes Mlh1-Pms1. Los EMSAs probaron la unión a proteínas en concentraciones que iban de 25 nM a 400 nM tanto en ADN superenrollado como linealizado. El ADN no B altera las funciones de reparación de proteínas y contribuye a la comprensión de la inestabilidad del ADN.

[ADN no B y proteínas de reparación del ADN (2025)]

Consideraciones importantes en la electroforesis del ADN plasmídico

En la electroforesis del ADN plasmidal, la optimización de la resolución electroforética es fundamental.

Sistema de gel horizontal HE-50: El sistema preferido

El Sistema de gel horizontal HE-50 de Longlight Technology, emplea un diseño uniforme que es beneficioso para la electroforesis del ADN plasmídico.

1. Separación de alta calidad

• Electrodos de platino puro 99,95%: un elemento de diseño crítico para resolver superbobinados a partir de isoformas cortadas.

• Formato de gel flexible: Los investigadores pueden elegir las dimensiones del gel con cualquiera de los cuatro tamaños de bandejas disponibles: 60×60 mm, 60×120 mm, 120×60 mm y 120×120 mm. El tamaño más grande ofrece una distancia de migración lo suficientemente larga para visualizar isoformas migratorias de cerca con mayor resolución.

2. Diseño orientado al usuario

• Bandeja de carga guiada con fondo negro: La regla fluorescente con fondo oscuro permite una alineación cuidadosa de la punta de la pipeta con los pozos cuando se cargan varias muestras para una comparación directa.

• Depósito de policarbonato de alta transparencia: Diseño de alta visibilidad con un tanque incorporado muestra la migración del frente del tinte y el proceso de electroforesis sin necesidad de abrir el tanque ni interrumpir el sistema.

3. Seguridad y eficiencia

• Tapa de cierre automático: Un interruptor de seguridad corta la alimentación cuando se abre la tapa para eliminar el riesgo de electroshock mientras los usuarios cargan muestras o retiran la gelatina.

• Bajo consumo de buffer: La cámara de migración inferior incorpora un diseño de puente que utiliza menos tampón y proporciona el entorno iónico suficiente para realizar electroforesis de ADN consistente y fiable.

Pasos para analizar isoformas de plásmidos

Para lograr la separación óptima del ADN plasmídico usando el sistema HE-50:

• Prepara el gel de agarosa: Elige cualquiera de los cuatro tamaños de bandejas para fundir un gel de agarosa al 0,8-1,0%. Analizar plásmidos de tamaño entre 3 y 10 kb con 1× geles de agarosa tamponados con TAE.

• Preparación de la muestra: Combina muestras de ADN plasmídico con tinte de carga. Utiliza entre 200 y 500 ng de ADN plasmídico. Las proporciones entre la muestra de tinte y el tinte de carga pueden ser 1:6, 1:3 o 1:1,5. Utilizando una pipeta, carga las muestras de colorante plasmídico en los pozos de agarosa.

• Electroforesis: Un gel con dimensiones 120 x 120 mm debe funcionar a 100 V. Para geles de 100 x 100 mm, usa 80V. El azul de bromofenol se deja actuar entre 45 y 60 minutos. La electroforesis se detiene cuando el tinte llega a dos tercios del camino hacia el fondo.

• Visualizar y documentar: La cubierta transparente y expuesta permite que un gel sea UV e imagobido mientras la cubierta sigue en su lugar. Cuando hay una regla molecular, se observa fluorescencia positiva.

• Cuantificar la distribución de isoformas: Los sistemas automatizados de documentación de gel cuantifican la intensidad de la banda. El porcentaje de ADN superenrollado está determinado por lo siguiente: [intensidad SC] / (Intensidades lineales SC OC) × 100.

Integración de flujos de trabajo sin obstáculos

El sistema HE-50 está diseñado para una integración sin obstáculos en los flujos de trabajo de laboratorio existentes:

• Integración de fuentes de alimentación: Los enchufes banana de 4 mm necesarios son compatibles con la mayoría de las fuentes de alimentación por electroforesis (recomendamos voltaje constante).

• Integración con sistemas de imagen: La tapa transparente a los rayos UV es compatible con los sistemas estándar de documentación de imágenes en gel, eliminando la necesidad de transferir geles de tanques a imágenes.

• Adopción de protocolos: El sistema es compatible con todas las concentraciones estándar de gel de agarosa y con buffers de electroforesis (TAE, TBE, SB), lo que permite la adopción de protocolos de análisis de plásmidos previamente publicados.

Conclusión

La electroforesis por ADN es el método más sencillo y popular para evaluar la calidad del ADN plasmídico. Los investigadores pueden utilizar su conocimiento sobre la migración de isoformas superenrolladas, cortadas y lineales para optimizar la separación e interpretar los resultados. El Sistema de Gel Horizontal HE-50 proporciona las capacidades — electrodos de platino puro, tamaños de gel seleccionables, guías de carga y controles — esenciales para el análisis rutinario de plásmidos. Como se indica en Nature Communications (2025) y NIH (2025), la electroforesis en gel de agarosa es uno de los métodos fundamentales para analizar las interacciones entre el ADN y las proteínas, así como la topología o estructura del ADN.

El Sistema de Gel Horizontal HE-50 tiene el potencial de integrarse completamente y ser modular a los sistemas de imagen; de este modo, ofrece a los clientes más opciones para sistemas asequibles de imagen de ADN plasmidical. Para obtener más información, por favor envíe una solicitud de presupuesto a Longlight Technology.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Puede la electroforesis en gel horizontal identificar ADN de plásmidos superenrollados y cortados?

El Sistema HE-50 puede identificar plásmidos de ADN superenrollados, cortados y lineales siempre que se logre uniformidad del campo eléctrico, y se utilicen geles de agarosa del 0,8-1,2%.

P2. ¿Cuáles son las diferentes tasas de migración de las distintas formas de plásmidos durante la electroforesis?

Debido a que las formas de plásmidos son estructuralmente diferentes, presentan tasas de migración variables cuando se someten a electroforesis. Por ejemplo, las formas plásmidicas lineales migran más rápido que las circulares. El ADN en forma lineal tiene una tasa de migración moderada, mientras que el ADN en forma cortada o circular abierta tiene la tasa de migración más lenta.

P3. ¿Qué porcentaje de ADN superenrollado se considera de alta calidad para la transfección?

Una forma superenrollada del ADN del plásmido que tenga más del 80% se considera generalmente una preparación de plásmidos de alta calidad para transfección y terapia génica.

P4. ¿Puedo usar el buffer TAE en lugar de TBE para separar isoformas de plásmidos?

Sí, en la mayoría de los casos el tampón TAE puede usarse para el análisis de plásmidos. Sin embargo, el tampón TBE es óptimo para separar isoformas de plásmidos cuando las diferencias son mínimas y en separaciones prolongadas.

P5. ¿Por qué mis muestras de plásmidos muestran múltiples bandas en el gel?

Normalmente se observan múltiples bandas para formas superenrolladas, cortadas y lineales del plásmido. Otras bandas pueden ser resultado de una mala digestión o contaminación degradada por ADN y ARN.