Guía de optimización para la fragmentación del ADN en muestras difíciles de lisar

La fragmentación del ADN es un paso fundamental en la preparación de muestras en diversas disciplinas, incluyendo genómica, diagnóstico molecular y proteómica. Sin embargo, la presencia de paredes celulares fuertes o tejidos rígidos supone un gran desafío para lograr una fragmentación del ADN consistente y de alta calidad. Esta guía aborda las dificultades asociadas a organismos y tejidos que se resisten a la lisis, ofrece algunas recomendaciones de optimización basadas en la evidencia y analiza las ventajas de la tecnología de ultrasonido focalizado.

[Fragmentación del ADN | AAT Bioquest]

Desafíos asociados a las muestras obstinadas para lisar

La variedad de muestras biológicas encontradas en laboratorios de investigación y clínicos abarca los reinos microbiano y vegetal. Las fuertes paredes celulares de organismos como micobacterias y cepas formadoras de esporas, así como los tejidos vegetales ricos en celulosa y lignina, resisten la mayoría de los métodos estándar de preparación de muestras.

¿Qué hace que algunas muestras sean reacias a la lisis?

• En comparación con las células animales, las membranas celulares de bacterias Gram positivas, micobacterias, hongos y plantas requieren más energía, ya sea mecánica o química, para ser alteradas.

¿Cuáles son los efectos de una lisis insuficiente?

• Una mala interrupción de las muestras resulta en bajos rendimientos de ADN, bibliotecas de secuenciación sesgada y efectos posteriores de la PCR, como baja eficiencia y deficiente cuantificación.

Para estos tipos de muestras, métodos estándar como la digestión química, los ciclos de congelación-deshielo y el batido de perlas dependen de la implementación de una alteración mecánica más controlada debido a sus resultados inconsistentes.

Avances en la comprensión de la fragmentación del ADN

Descubrimientos científicos clave sentaron una base para entender la fragmentación. En un importante estudio de 2025, Fu et al. inventaron un método de cizalladura ultrasónica mediado por perlas de circonia que, con solo 20 segundos de sonicación, podría producir tamaños de fragmentos de aproximadamente 15 pares de kilobases a partir de λADN purificado. Este método amplió los límites de la secuenciación de molécula única (SMS) al proporcionar una solución al cuello de botella de la producción ineficiente de fragmentos de ≥10 kbp utilizando técnicas tradicionales de cizallamiento ultrasónico para la preparación de bibliotecas de SMS.

[Una estrategia ultrasónica rápida y eficiente mediada por perlas de circonia para

Fragmentación del ADN hasta 10 kbp - RSC Advances

En otro trabajo importante publicado en 2025, Hahmann y colegas del Instituto Max Planck de Investigación de Polímeros y de la Universidad RWTH de Aquisgrán describieron el uso de ultrasonido para lograr la fragmentación controlada por secuenciación del ADN. Este trabajo describió la redirección de fragmentaciones previamente aleatorias hacia puntos débiles específicos y deliberados de una cadena de ADN parcialmente cortada mediante tallas. Publicado en la revista Chem, este trabajo ofreció nuevas ideas y dimensiones adicionales para el desarrollo de protocolos que lograran la fragmentación controlada de muestras complejas y desafiantes.

Desafíos y consideraciones en la fragmentación del ADN

[Johannes Hahmann, Boris N. Schüpp, Aman Ishaqat, Arjuna Selvakumar,

Robert Göstl, Frauke Gräter y Andreas Herrmann.

"Mecanoquímica específica de secuencia y libre de mecanóforos del ADN." Chem (2025).]

Para lograr la fragmentación del ADN en muestras resistentes, es necesario controlar y ajustar finamente varios parámetros. Los resultados pueden mejorarse ajustando lo siguiente:

• Intensidad y amplitud de ultrasonidos: Una mayor intensidad produce más cavitación y mejor disrupción. Una mayor intensidad también aumenta el riesgo de daños térmicos y mecánicos en las muestras.

• Tiempo de procesamiento: La sonicación prolongada puede provocar una sobrefragmentación inaceptable.

• Volumen y concentración de muestras: La energía de entrada para muestras diluidas y concentradas varía. Esta diferencia debe medirse para determinar el volumen óptimo de muestras.

• Composición del tampón: El uso de detergentes y quelantes provoca un debilitamiento sinérgico de las paredes celulares y se ve potenciado por la interrupción mecánica, mejorando así el rendimiento.

• Control de temperatura: La pérdida de estabilidad térmica puede provocar que las muestras fragmentadas se desnaturalicen y pierdan integridad estructural. Esto puede ocurrir si el sistema se encuentra en condiciones isotérmicas.

• El número de cuentas y su tamaño: En la fragmentación de cuentas, el tamaño y número de cuentas son importantes.

Saputra et al. (2024) compararon varios enfoques de extracción de ADN. Demostraron que la sonicación resultaba en ADN de alta calidad. Según sus datos, el 61% del ADN sonicado tenía una absorbancia entre 1,8 y 2,0, siendo el fondo de longitud de onda inferior menos pronunciado. En cambio, la extracción de ADN mediante métodos de columna de spin resultó en un mayor rendimiento del ADN extraído. Esto demuestra que en algunos métodos diagnósticos, la pureza de la muestra puede ser más importante que la concentración de la muestra.

Tecnología de Ultrasonido Focalizado: Una Alternativa de Precisión

Las técnicas comunes de métodos basados en sonicación presentan varias desventajas. Los sondadores de sonda provocan contaminación de muestras y requieren una limpieza intensiva, y en última instancia son la causa del calentamiento incontrolado de las muestras. Los sonicadores de baño maria dispersan la energía y producen resultados inconsistentes.

Plataformas de ecografía enfocadas, como BoFU-800, utiliza un diseño completamente diferente. Eliminar la pérdida de energía y obtener resultados altamente repetibles, así como fiabilidad al procesar muestras difíciles, son solo algunas de las ventajas añadidas de la sonicación.

• Procesamiento sin contacto: Los sistemas de energía enfocada sonican un medio acústico a la muestra. El contacto entre muestra y sonda se elimina y la contaminación de la muestra es poco probable.

• Control real de baja temperatura: El calor del procesamiento ultrasónico no influye en los resultados. Con nuestra mejora en la medición y control de las temperaturas, podemos realizar cambios precisos y deliberados en las temperaturas dentro de las muestras.

• Rendimiento adaptable: Cada una de las ocho posiciones de muestra puede tener configuraciones individuales y personalizadas para el usuario. El usuario también puede procesar de una a ocho muestras. El sistema permite rendimientos flexibles.

• Modo de procesamiento por lotes: Cuando la muestra en cada posición es la misma, se pueden aplicar ajustes personalizados a todas las posiciones de la muestra. Esto permite al usuario procesar varias posiciones de muestra con un solo comando.

• Trazabilidad total: La información sobre el procesamiento de cada muestra puede ser accedida en cualquier momento, permitiendo la trazabilidad total de los registros experimentales.

Aplicación a tipos específicos de muestra

Micobacterias

La pared celular de Mycobacterium tuberculosis es rica en ácidos micólicos y es extremadamente difícil de penetrar. El ultrasonido focalizado genera cavitación mecánica y rompe la pared celular para completar el paso de lisis del núcleo en unos 60 segundos. El tiempo total para completar el proceso desde el cultivo en la colonia hasta el extracto de la muestra es inferior a cinco minutos.

Hongos filamentosos

Las paredes celulares de los hongos filamentosos contienen quitina y glucanos. Aunque pueden ser difíciles de penetrar, la ultrasonicación enfocada puede reducir el tiempo de preparación de la muestra a menos de cinco minutos y requiere solo 60 segundos de sonicación.

Materiales vegetales

Los principales componentes de las paredes celulares vegetales son la lignina y la celulosa. Para la ecografía enfocada, su capacidad para una homogeneización y fragmentación uniformes y consistentes es importante para cubrir las diversas necesidades que abarcan la extracción de ADN de tejidos vegetales y animales.

Muestras de FFPE

Para los tejidos FFPE, el entrecruzamiento de formaldehído presenta desafíos en todas las etapas del proceso. El ultrasonido focalizado agiliza la preparación de la muestra combinando la deparafinización, la lisis y la fragmentación del ADN en un solo paso rápido y eficiente, maximizando el rendimiento de la muestra.

Ejemplo de protocolo óptimo

Al trabajar con un nuevo tipo de muestra difícil de analizar, la estrategia de desarrollo de protocolos más eficaz es la siguiente:

• Utiliza la configuración del fabricante como referencia: A menudo, los protocolos específicos de cada tipo de muestra están precalibrados y se puede confiar en ellos.

• Definir tamaños aceptables de fragmentos: Para NGS, los tamaños de fragmentos de construcción de bibliotecas suelen estar entre 300 y 500 bp, mientras que la secuenciación de lectura larga es ≥ 10 kbp. Ten en cuenta el tamaño adecuado.

• Duración del corte de potencia constante en experimentos de curso temporal: Optimizar la duración de la ventana temporal.

• Validación por electroforesis: En estudios de curso temporal, se considera la preparación de la muestra y el tamaño del fragmento.

• Documentar y comunicar todos los parámetros requeridos: para que un paso de preparación de muestra se replique exactamente, debe estar completamente documentado en los protocolos asociados.

• Control térmico: La temperatura de la muestra debe mantenerse dentro del rango objetivo para evitar la introducción de artefactos térmicos.

Direcciones futuras

Tras algunos de estos estudios citados anteriormente de 2025, seguiremos viendo la integración del diagnóstico clínico y la ingeniería con la biología molecular, lo que conduce a la creación de herramientas avanzadas y más potentes para la fragmentación del ADN.

Lei et al demostraron cómo los dispositivos de ultrasonido enfocados de alta intensidad miniaturizados, con la capacidad de adaptar la fragmentación de muestras de dispositivos comerciales, pueden resolver problemas de contaminación cruzada y procesamiento inconsistente con sistemas tradicionales. Este es un paso hacia una extracción más automatizada e integrada de ácidos nucleicos, y la preparación de muestras en laboratorio se estandarizará y estará más disponible.

Para laboratorios de investigación y diagnóstico que incorporan tecnología de ultrasonido enfocado para optimizar la fragmentación de muestras difíciles de lisisar, los beneficios de la tecnología de ultrasonido enfocado, que incluyen precisión, facilidad de implementación y reproducibilidad, son muy convincentes. La combinación de flujos de trabajo validados para una amplia gama de tipos de muestras, como micobacterias, hongos filamentosos, tejidos vegetales y secciones FFPE, en un solo dispositivo, mejora la eficiencia del laboratorio y la calidad de los datos generados, y potencia y acelera la traducción de la investigación científica y la práctica clínica.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Qué es la fragmentación del ADN? ¿Qué papel tiene para los ejemplares difíciles de lisar?

R. La fragmentación del ADN es necesaria para la preparación de bibliotecas NGS. La fragmentación en sí misma es romper el ADN en fragmentos más pequeños. La secuenciación de nueva generación emplea análisis de ADN con diversos ejemplares difíciles de lisar, como plantas y bacterias, que resisten la lisis convencional.

P2. ¿Puede la ecografía enfocada penetrar a las micobacterias sin ningún tratamiento químico?

R. La ecografía enfocada proporciona suficiente energía y estrés a la capa micólica de las micobacterias y, en consecuencia, puede reducir el tratamiento químico o eliminarlo por completo.

P3. ¿En qué se diferencia la ecografía enfocada del batido de perlas para los tejidos vegetales?

R. La ecografía enfocada es sin contacto e isotérmica, ofreciendo un tratamiento mecánico más uniforme y de cizalladura que facilita un mayor control y reducción de la degradación tisular en comparación con el batido de perlas.

P4. ¿Cuál es el tamaño típico de los fragmentos de ADN al emplear ultrasonicación enfocada?

R. El tamaño de los fragmentos puede variar mucho más allá de 10 kb, y la ecografía puede usarse para atacar fragmentos de 300-500 bases, mientras que el tamaño típico para la secuenciación de próxima generación es aproximadamente de 300-500 bases.

P5. ¿Funciona la ecografía enfocada para fragmentar ADN de FFPE?

R: La ecografía enfocada es capaz de lograr eficazmente la deparafinización FFPE y la lisis celular mientras se corta el ADN reticulado. El proceso de ecografía es rápido y aumenta el rendimiento global del ADN fragmentado.