Cizallamiento de cromatina: Cómo construir un flujo de trabajo reproducible de ChIP

Cortar la cromatina es uno de los pasos más sensibles en un protocolo ChIP. Fragmentos demasiado grandes pueden provocar una disminución en la resolución y una mala inmunoprecipitación. Un cizallamiento de intensidad demasiado alta puede provocar daños en epítopos, complejos ADN–proteínas y material recuperable.

Ningún programa único funcionará para todas las muestras. La respuesta de la cromatina a la energía ultrasónica varía según el tipo de célula, fijación, material de partida y dependiendo de la eficiencia de la lisis por cromatina y el volumen de la muestra. Todo el proceso de preparación debe controlarse para obtener resultados fiables, en lugar de limitarse a cambiar el tiempo de sonicación.

¿Qué es Cizallamiento ¿de Cromatina?

Antes de la inmunoprecipitación, el corte de la cromatina descompone la cromatina entrecruzada en fragmentos más pequeños de ADN, proteínas. Los anticuerpos pueden entonces utilizarse para enriquecer la cromatina asociada a un factor de transcripción particular, histona o modificación de histonas.

Tras la inmunoprecipitación, los enlaces cruzados se invierten, el ADN se purifica y las regiones enriquecidas se analizan mediante qPCR o secuenciación. Longlights Soluciones ChIP-seq proporcionar asistencia en el estudio de las interacciones proteína–ADN y de los sitios reguladores genómicos.

El cizallamiento de la cromatina difiere de la fragmentación del ADN purificado porque los nucleosomas, las proteínas asociadas y los enlaces cruzados de formaldehído alteran la accesibilidad del ADN y sus propiedades mecánicas.

Por qué es Fragment Tamaño ¿importante?

Los fragmentos grandes disminuirán la resolución posicional porque el ADN recuperado puede ser mucho más largo que el sitio de unión a la proteína. También pueden aumentar el fondo cuando hay regiones alrededor que no son específicas pero que aún están físicamente conectadas.

No des por hecho que piezas muy cortas son necesariamente mejores. Un procesamiento excesivo puede llevar a la pérdida de rendimiento por inmunoprecipitación, pérdida de epítopos sensibles o a un perfil de biblioteca inadecuado.

El tamaño óptimo del fragmento variará en función del protocolo ChIP, el objetivo biológico, el anticuerpo utilizado y el análisis posterior. Por lo tanto, los laboratorios deberían establecer una distribución aceptable para su propio ensayo y no solo un tamaño medio universal.

¿Y qué pasa con eso? Cizallamiento ¿con reticulación?

La reticulación mantendrá la interacción proteína-ADN, mientras que una reticulación demasiado intensa puede dificultar la fragmentación de la cromatina y puede ocultar los epítopos de los anticuerpos. Las interacciones débiles o transitorias pueden perderse por fijación insuficiente.

El tiempo de fijación varía según el tipo de muestra, la concentración de los reactivos, la densidad celular y la proteína objetivo. El templado también debe ser uniforme, ya que el comportamiento de las muestras cambiará tras una nueva reticulación.

Si la muestra sigue resistiendo el corte a pesar de aumentar la cantidad de energía acústica, esto no resolverá el problema subyacente. Las condiciones de reticulación y temple deben considerarse antes de adoptar un programa más agresivo.

Por qué la entrada de celda y ¿La lisis es importante?

Un exceso de células en una pequeña cantidad puede crear cromatina gruesa y pegajosa que se corta de forma irregular. Un material inicial muy bajo puede aumentar las pérdidas de manipulación y dificultar la evaluación de la calidad de la cromatina.

El número de células entre experimentos debe igualarse. Las muestras de tejido requieren un cuidado especial ya que existe un alto riesgo de obtener un lisado heterogéneo debido a material extracelular, diferencias estructurales y disociación incompleta.

Antes de la sonicación, la liberación efectiva de núcleos y cromatina es crucial. La lisis incompleta puede resultar en la presencia de núcleos no rotos o grupos de células que están expuestos a la energía de forma diferente al resto de la muestra.

Qué concentración Ultrasonicación ¿Ayuda a mejorar el control?

Se utilizan sondadores de sonda donde la energía se transmite directamente a la muestra. La variabilidad y el potencial de contaminación pueden deberse a la posición de la sonda, la profundidad de inmersión y la técnica del operador.

La ultrasonicación enfocada se utiliza para dirigir la energía acústica, a través de un medio de acoplamiento, hacia un recipiente de muestra cerrado. Esto da como resultado un entorno de procesamiento sin contacto más controlado.

El Ultrasonicador enfocado BoFU-100 proporciona cizalladura controlada por ADN, ARN y cromatina. El Sistema BoFU-1600 ofrece la opción de un flujo de trabajo de laboratorio multicanal al procesar múltiples muestras.

¿Qué parámetros deben optimizarse?

La intensidad acústica, el ciclo de trabajo, el tiempo de tratamiento, el número de ciclos, el tiempo de pausa, el volumen de la muestra y la temperatura de la muestra son variables importantes.

Cambiar una variable principal a la vez durante la optimización inicial. Cuando la intensidad y la duración y/o concentración celular varían simultáneamente, puede ser difícil determinar si el resultado fue mejor o peor debido a cualquiera de los dos cambios.

Prueba una pequeña matriz de condiciones alrededor de un punto de partida razonable y compara las distribuciones de fragmentos y la recuperación de ADN

- ¡NO el tratamiento más fuerte que resulta en el ADN más corto!

Tras la selección de un programa, guarda el programa con la entrada de medición de la celda, el buffer, el tubo y el volumen de la muestra. Sin estas condiciones acompañantes, los parámetros de sonicación no pueden reproducirse de forma fiable.

¿Por qué es así? Importante ¿que las muestras deben mantenerse frías?

El tratamiento ultrasónico va acompañado de efectos de calor y la cromatina puede ser sensible al calor. El daño a las proteínas, la pérdida de reconocimiento de anticuerpos y el aumento de la variabilidad pueden ser factores del calor.

El enfriamiento durante toda la prueba debe ser el mismo (incluso durante el descanso entre pasadas). La velocidad de movimiento de los tubos entre un cubo de hielo y el instrumento no debería afectar a la temperatura de la muestra.

Cizallamiento Calidad Comprobación: ¿Cómo?

Después del esquilamiento, toma una alícuota representativa. Invierte los enlaces cruzados, limpia el ADN y evalúa toda la distribución del tamaño del fragmento con electroforesis en gel de agarosa o un analizador automatizado de fragmentos adecuado.

No evalúes la cromatina reticulada sin tratar como si fuera ADN purificado. El tamaño aparente puede ser engañoso debido a un cambio en la migración causado por proteínas y entrecruzamientos.

La mayor parte del material debe estar dentro de los límites del rango "aceptado" del laboratorio, con poca o ninguna población grande de material de alto peso molecular. La cantidad de ADN recuperada también debe medirse, ya que un buen perfil no es valioso si gran parte del ADN se ha perdido.

¿Por qué hay Inconsistente ¿Cizallamiento por cromatina?

Estas se deben a fijaciones variables, conteos celulares inexactos, lisis incompleta, volumen de muestra variable, tipos variables de tubos y deriva de temperatura.

La espuma o las burbujas de aire son un problema que puede afectar al acoplamiento acústico. Por lo tanto, los tubos de muestra deben llenarse, taparlos y colocarse de la misma manera. Para el desarrollo de métodos, se prefieren tubos de un tipo validado/lote validado.

Si hay una variación entre los resultados de un lote, esto podría indicar que existen efectos en la posición de la muestra o que el tiempo de preparación de la muestra puede haber sido inconsistente. Un simple registro de ejecuciones puede ser útil para ver si hay alguna variación relacionada con el biológico, procedimientos o instrumentos.

¿Cómo debería optimizarse un nuevo tipo de muestra?

Empieza con una pequeña fijación y matriz acústica con material representativo de un experimento real. No uses un ejemplar valioso o no reemplazable para la prueba inicial.

Evaluar la distribución de fragmentos, la recuperación de ADN y el rendimiento en inmunoprecipitación. Tras el cizallamiento, la idoneidad de la cromatina para ChIP puede evaluarse utilizando un anticuerpo de control positivo y loci objetivo conocidos.

Una vez optimizado, establece los parámetros críticos en una SOP. Para más información sobre ultrasonidos enfocados para la preparación de cromatina, consulta Longlight Página de solicitud ChIP.

Conclusión

No se trata solo de la potencia ultrasónica para lograr un cizallamiento fiable de cromatina. Los distintos componentes de fijación, entrada celular, lisis celular, geometría de la muestra y condiciones acústicas y de temperatura deben ser todos compatibles.

El método óptimo proporciona la distribución adecuada de fragmentos y mantiene el rendimiento de inmunoprecipitación y recuperación del material. Cada laboratorio puede contactar con Longlight a través de la página de contacto para proporcionar información sobre el tipo y lote de su muestra y el flujo de trabajo ChIP que desean utilizar, tanto para el soporte de equipos como de aplicaciones.

Preguntas más frecuentes

Q1. ¿Por qué es necesario el corte de cromatina?

Rompe la cromatina reticulada a fragmentos más pequeños para IP. El uso de fragmentos de tamaño controlado aumentará la resolución de ChIP-qPCR y ChIP-seq.

Q2. ¿Qué pasaría si la cromatina está poco cortada?

Las piezas muy grandes pueden causar pérdida de resolución y aumento del fondo inespecífico. Considera reevaluar la fijación, la lisis y las condiciones acústicas antes de prolongar automáticamente el tratamiento.

Q3. ¿Es posible sobrecortar la cromatina?

Sí. Si se usa demasiado tratamiento, la recuperación se verá afectada o los epítopos proteicos y complejos ADN–proteína se dañarán. No siempre es buena idea usar fragmentos más cortos.

Q4. ¿Es necesario mantener la cromatina en hielo durante la sonicación?

Sí. El procesamiento a baja temperatura es estable, lo que ayuda a reducir el daño a las muestras y proteínas causado por el calor. La temperatura debe ser constante entre muestras y lotes.

Q5. ¿Hay una sola cromatina-ellaa¿Programa en anillo que sea aplicable a todos los tipos de células?

Normalmente no. La diferencia entre estructura celular, densidad de cromatina, respuesta de fijación y concentración de muestra existe, y los nuevos tipos de muestra deben estar sujetos a una optimización limitada.