Cryo-Electron Tomography (Cryo-ET): Is Your Sample Ready for In Situ Structural Biology?

Las aplicaciones más prometedoras de la criotomografía electrónica no son solo: "¿Cómo es esta proteína?", sino también: "¿Cómo es esta estructura donde realmente funciona?"

Esa distinción importa. El complejo purificado también puede ofrecer un nivel perfecto de detalle estructural eliminando membranas, complejos adyacentes, estructura celular o vírica importante para la cuestión biológica. Cryo-ET aborda este reto de una manera diferente, tomando muchas proyecciones de una muestra vitrinada para reconstruir un volumen 3D.

Actualmente, Longlight ofrece Cryo-ET como un enfoque estructural in situ para ensamblajes biológicos, complejos asociados a membranas y sistemas virales como parte de su Servicio de criomicroscopía electrónica.

La cuestión práctica, sin embargo, para la recopilación de datos es,

¿Es realmente la pregunta biológica una que sí requiere tomografía?

Toma la cuestión biológica antes que el microscopio

A veces, los científicos comparan el crio-ET con el análisis de partícula única, sugiriendo que uno tenía que ser superior al otro.

Normalmente no es una comparación directa.

La criogenia de partícula única podría ser un camino más directo hacia una estructura promediada de alta resolución si un complejo macromolecular purificado y relativamente homogéneo puede responder a la pregunta biológica. Sin embargo, el Crio-ET resulta muy atractivo si la posición/orientación, el entorno molecular, el entorno de la membrana o la organización celular del objetivo son relevantes.

Longlight's guía para crio-EM de resolución casi atómica ofrece algo de contexto sobre el camino de partícula única; Crio-ET plantea otra pregunta: ¿qué se puede observar cuando se mantiene el contexto biológico?

Primer límite físico—accesibilidad electrónica

Si una muestra es biológicamente interesante, no significa necesariamente que sea una muestra accesible por electrones.

La tomografía criogénica directa puede ser posible para virus u otros orgánulos aislados, pequeñas células y áreas periféricas delgadas de las células. Algunos flujos de trabajo in situ incluyen el adelgazamiento de muestras, necesario para la imagen útil de transmisión de células eosinucleicas más grandes que son demasiado gruesas para ser fotografiadas.

Un método bien establecido para fabricar láminas delgadas de células es el fresado por haz de iones criofocalizado (FIB). Las células eucariotas crio-FIB molidas se han utilizado para estudios in situ para hacer accesibles estructuras internas para tomografía y posterior análisis estructural.

¡La planificación de muestras no debería empezar con el voltaje del microscopio! Debe incluir 'desde dónde' y 'cómo' el haz de electrones llegará al objetivo.

Una serie Tilt NO es un montón de fotos, es un Dose Budget.

Cryo-ET no obtiene la información sobre la tercera dimensión a partir de una sola exposición.

Este ejemplar se inclina muchas veces y se capturan una serie de proyecciones 2D. Esto se debe a la sensibilidad a la radiación de las muestras biológicas congeladas y las proyecciones deben tener un presupuesto total limitado de dosis electrónicas. El grosor efectivo por el que pasan los electrones también aumenta a ángulos de inclinación mayores, lo que significa que puede ser utilizable menos señal.

En tomografía convencional, tampoco es posible una adquisición completa de ±90° debido a la geometría mecánica y al grosor de la muestra. La información no muestreada crea la conocida cuña ausente en el espacio de Fourier.

Pero más proyecciones no significan necesariamente mejor. Debe considerarse la interacción entre el rango de inclinación, la distribución de la dosis, la calidad de la alineación, la estabilidad de la muestra y la visibilidad del objetivo.

Determina si necesitas un tomograma, una estructura repetida.

¡No todos los proyectos de crio-ET tienen que culminar en un modelo molecular casi atómico!

A menudo, la tomografía por sí sola da la respuesta a la pregunta: ¿Dónde se encuentra una estructura? ¿Qué ocurre con una membrana cuando está distorsionada? ¿Cuál es la organización de los componentes virales? ¿Qué complejos están adyacentes entre sí?

Se mostrará un objetivo diferente cuando existan múltiples copias del mismo complejo macromolecular. Los objetivos repetidos pueden extraerse como subtomogramas, alinearse, clasificarse y promediarse para potenciar la señal estructural.

En este artículo, Longlight ya ofrece una explicación detallada de esta ruta. La cuestión clave para un nuevo proyecto se plantea desde el principio: ¿Es esta una arquitectura 3D única o hay suficientes copias similares para promediar?

El cuello de botella oculto puede convertirse en la localización del objetivo.

Elegir la mejor zona móvil puede ser tan importante como obtener una serie de inclinación técnicamente adecuada.

Supongamos que el objetivo es solo una pequeña parte de una celda grande. Aunque tengas un tomograma bonito de la zona equivocada, sigue siendo el conjunto de datos equivocado.

Para ser recogidas, deben tener en cuenta la abundancia del objetivo, la localización aproximada de las células, su morfología reconocible, la información disponible sobre el marcaje y si es necesaria otra estrategia de localización.

Este mapa biológico puede mejorar significativamente la lógica del plan de adquisición para objetivos asociados a membranas, sitios de ensamblaje viral, orgánulos o complejos espacialmente restringidos.

Planificación previa a la sesión para Data Path:

Cuando se ha adquirido una serie inclinable, un proyecto Crio-ET no está completo.

Las imágenes deben alinearse, reconstruirse en tomogramas y examinarse, buscar objetivos y segmentarse, y si es adecuado, transferirse a la extracción de partículas, clasificación y promediado subtomograma.

Por eso el entregable deseado debe establecerse antes de la cobranza.

En el actual servicio Cryo-EM de Longlight, nos centramos en la entrega de mapas finales de densidad, pero también de datos en bruto y archivos de procesamiento intermedios. Esto es útil cuando un investigador quiere revisar decisiones de procesamiento, realizar análisis posteriores dentro del sistema o volver al conjunto de datos en una fecha posterior.

Empareja la plataforma con la fase del proyecto

La calidad del instrumento no debe usarse para remediar una pregunta de muestra indeterminada.

El cribado inicial puede indicar si la preparación de la muestra, la distribución de partículas, la calidad del hielo y/o la visibilidad del objetivo deben mejorarse antes de invertir el costoso tiempo de recogida.

Longlight ha anunciado hoy una plataforma crio-EM por etapas que consiste en Talos L120C G2 para cribado, Glacios 2 a 200 kV para crio-EM/tomografía rutinaria y Titan Krios G4 a 300 kV para adquisición exigente de alta gama. También está vinculado a los flujos de trabajo de proteínas aguas arriba a través de su amplio alcance Aplicación de proteínas cartera que combina análisis estructural con su cartera.

La regla general de investigación es:

La muestra está lista, pasa al siguiente instrumento, no porque esté disponible.

Esta es la Comprobación Final del Proyecto Crio-ET.

En cuanto a la toma crioelectrónica de una muestra, hay cinco cuestiones a considerar:

¿Es necesario tener contexto espacial nativo? ¿Es accesible el área de interés de la molécula para el electrón? ¿Hay una mira fiable del objetivo? ¿Puaj, un tomograma o partículas repetidas? ¿Sabes qué tipo de productos de datos serán necesarios tras la adquisición?

Una vez decididas esas respuestas, la selección del equipo y la estrategia de procesamiento se vuelven mucho más sencillas.

El poder de la crio-ET es que preserva la información que se pierde durante la purificación. Sin embargo, esto solo será útil si la preparación de la muestra, la estrategia de imagen y la cuestión biológica se diseñan conjuntamente como un solo proyecto.

Los investigadores pueden consultar con Longlight En un proyecto estructural in situ, después de describirles el tipo de muestra que van a utilizar, la ubicación objetivo, el tipo de estructura que buscan lograr y el análisis posterior que van a utilizar.

Preguntas más frecuentes

P1. ¿Tomografía crioelectrónica (Crio-ET)?

La crio-ET consiste en tomar varias imágenes de una muestra biológica en las vitrinas desde diferentes ángulos y luego reconstruirla en un tomograma 3D. Un beneficio importante es que mantiene la información estructural en un entorno biológico cercano al nativo.

P2. ¿Cuáles son las condiciones adecuadas para usar crio-ET en lugar de crio-EM de partícula única?

Considera crio-ET cuando la posición de la célula, la organización de la membrana, los vecinos moleculares o la arquitectura nativa son factores clave para la cuestión de investigación. Cuando la partícula purificada/estructura molecular promediada es el foco, la SPA suele ser más directa.

P3. ¿Debería usarse el fresado criofínico (FIB) para todas las muestras de crio-ET?

No. Es posible obtener imágenes directas de especímenes aclarados de forma natural. En regiones más gruesas de la célula, puede ser necesario adelgazar para crear una parte electrón-transparente de la célula y así adquirir la tomografía.

P4. ¿Qué falta en Crio-ET?

Carece de información 3D del rango angular limitado que se puede adquirir durante la serie de inclinación. Puede causar anisotropía y artefactos de reconstrucción, que deben tenerse en cuenta en el análisis.

P5. ¿Es necesario realizar el promedio subtomográfico para cada proyecto realizado en crio-ET?

No. Un solo tomograma puede ser suficiente para responder preguntas relacionadas con la morfología u la organización espacial. El valor del promedio por subtomograma reside en la posibilidad de alinear y promediar varias copias similares de un objetivo cuando están disponibles.