Sistema de imagen de biología molecular: Elegir la plataforma adecuada para geles y manchas

Un sistema de imagen de biología molecular proporciona una salida digitalizada de un gel o membrana que puede ser vista, cuantificada, almacenada y comparada. Se puede configurar para escanear geles que contienen ADN y ARN, geles de proteínas teñidas, Western blots quimioluminiscentes, blots fluorescentes y muestras colorimétricas.

Se debe usar un sistema para ajustar el ensayo y no al revés.

¿Cómo funciona un Sistema de Imagen de Biología Molecular?

Un sistema de imagen estándar incluiría una cámara hermética a la luz, cámara, objetivo, etapa de muestreo, fuentes de luz que puedan usarse para la excitación deseada, filtros que permitan que solo pase luz con una cierta frecuencia de emisión, software para que la cámara registre la imagen y software para analizarla.

En el caso de los geles de ácidos nucleicos, el instrumento ilumina con luz UV, azul u otra luz adecuada sobre una tinción fluorescente. La luz blanca se utiliza frecuentemente para los geles de proteínas que son visibles. La luz producida en las manchas Western quimioluminiscentes es de su propia creación y proviene de una reacción química, por lo que se necesita una cámara sensible y una cámara de imagen oscura, pero no una luz de alta intensidad en la muestra.

Algunas plataformas todo en uno cuentan con capacidades de documentación en gel, imagen colorimétrica, quimioluminiscencia y fluorescencia en un solo recinto. Por ejemplo, bio-Rad proporciona sistemas para imágenes de geles de ácidos nucleicos y proteínas y manchas quimioluminiscentes, y los sistemas pueden expandirse con un canal visible, canales fluorescentes en rojo lejano y infrarrojo cercano.

Puedes empezar con las muestras que sí tomes

El primer lugar para empezar es en el laboratorio de laboratorio, ¡no en la hoja de especificaciones!

Para un laboratorio docente con un enfoque principal en geles de agarosa, la imagen UV, azul y blanca podría ser los únicos tipos necesarios. Un laboratorio preciso de investigación de proteínas requiere una delicada quimioluminiscencia y varios canales fluorescentes.

Thermo Fisher divide sus sistemas de visualización en aquellos que proporcionan visualización sencilla y aquellos que proporcionan análisis de software, así como Western blot quimioluminiscente e imagen fluorescente multicanal. Un recordatorio útil: el sistema de documentación en gel no es necesariamente un instrumento tan importante como el multimodo de la imagen molecular.

Empareja la fuente de excitación y el filtro con la tinte

Cada tinte fluorescente tiene un rango óptimo de longitudes de onda para su iluminación y para la emisión de luz. El sistema de imagen debe estar equipado con una fuente de luz adecuada para excitar el tinte, y con un filtro de emisión que permita que los fotones de emisión (fluorescencia) lleguen a la cámara mientras rechaza la luz utilizada para excitar el tinte.

A continuación se presentan ejemplos de sistemas que pueden contener:

• Transiluminación UV
• Transiluminación con luz azul
• Luz blanca transmitida
• Luz blanca reflejada
• Excitación fluorescente visible
• Excitación fluorescente en el infrarrojo cercano

No existe correlación entre el número de fuentes de luz y su calidad. La clave es si las longitudes de onda y los filtros instalados son compatibles con las tinturas, anticuerpos y etiquetas fluorescentes que ya se usan en el laboratorio.

Consulta la lista de reactivos del laboratorio antes de comprar un sistema para asegurarte de que está soportado por las aplicaciones. Por favor, ten en cuenta que no todos los tintes fluorescentes pueden ser capturados porque el sistema se denomina "imagen de fluorescencia".

La quimioluminiscencia y la fluorescencia son muy similares

En el blot western quimioluminiscente, la luz se genera mediante una reacción quimioluminiscente que suele basarse en una enzima de anticuerpos y un sustrato luminiscente. La señal cambiará con el tiempo: la imagen debe iniciarse dentro del rango de tiempo de trabajo recomendado para el reactivo.

El western blot realizado por fluorescente requiere la luz externa de la excitación. Puede utilizarse para multiplexar experimentos, de modo que se pueden detectar múltiples objetivos en la misma membrana a través de diferentes canales fluorescentes.

La quimioluminiscencia se emplea generalmente para la detección sensible y rutinaria. Cuando la multiplexación, la captura estable de señal o la comparación cuantitativa son cruciales, a menudo se elige la fluorescencia. No existe un método único y el mejor, ya que dependerá de los requisitos del ensayo, la cantidad de objetivo, los anticuerpos, las etiquetas utilizadas y los objetivos del análisis.

Si un laboratorio realiza rutinariamente ambas pruebas, debe asegurarse de que el sistema propuesto permita que las pruebas se realicen tal cual y sin la intervención de cambios complejos en el hardware.

Al fotografiar, considera el rango dinámico y la saturación

Algunos blot pueden tener una banda muy fuerte y varias bandas débiles. La banda fuerte podría saturarse si la exposición fuera lo suficientemente larga como para mostrar las señales tenues.

Cuando hay tanta luz que los píxeles de la cámara ya no pueden capturar. A partir de ese momento, la claridad aparente de la banda mostrada se conservará, pero el nivel de intensidad no podrá usarse para una comparación cuantitativa.

El rango dinámico es el rango de señales débiles a fuertes que un sistema de imagen puede registrar en una sola imagen. Un rango dinámico mayor permite grabar más fácilmente las bandas tenues e intensas sin perder ninguna información.

Algunas plataformas de imagen pueden detectar píxeles saturados, sugerir una exposición adecuada o usar exposiciones múltiples. Pueden reducir el número de pruebas de prueba y error, pero no están pensadas para sustituir un buen diseño experimental. Incluso si las muestras están sobrecargadas, deben corregirse durante la fase de ensayo y también deben corregirse las señales de anticuerpos demasiado fuertes.

Se debe evitar el uso de la exposición automática

La exposición automática puede ser útil si varias personas se turnan en el instrumento, o si hay factores que dificulten medir la intensidad de la señal.

Algunos sistemas obtienen exposiciones iniciales cortas y luego sugieren una exposición global basada en eso. La fuente de luz, el enfoque y los ajustes de aplicación son seleccionados automáticamente por otros.

Esto puede permitir que las imágenes rutinarias sean más rápidas, pero por favor consulte con el operador. Comprueba si:

• Nota: La saturación se indica para bandas importantes.
• Se pueden ver bandas débiles sobre el fondo
• Todo el campo de visión está cubierto por la muestra completa.
• Para obtener los mejores resultados, se utilizó el modo de imagen correcto.
• Se usaron el filtro y la bandeja necesarios
• A continuación se presentan análisis cuantitativos y requieren los trajes de exposición:

Los ajustes automáticos son un buen punto de partida, pero NO una excusa para no inspeccionar la imagen.

Asegúrate de que la resolución, sensibilidad y campo de visión sean correctos

La resolución es importante para la imagen capturada por una cámara, pero el número de megapíxeles no indica la calidad de imagen de una cámara.

También es importante contar con un sistema útil que sea suficientemente sensible, con bajo fondo, buena óptica, uniforme y con un campo de visión lo suficientemente amplio para acomodar los geles o membranas utilizados en el laboratorio.

Si las señales quimioluminiscentes son débiles, será necesaria una cámara muy sensible. Cuanto mayor es la distancia entre bandas, menos resolución se necesita; cuanto menor sea la distancia entre bandas y más importante es tener resolución, y cuanto menor es la característica de la muestra a separar, mayor será la resolución.

Coloca la bandeja de gel de laboratorio, la bandeja de blot o la bandeja multi-gel más grande en el lugar de la imagen antes de comprarla. Si un gel grande se corta en varias imágenes, se desperdicia el esfuerzo y las comparaciones serán más difíciles.

Asegúrate de que las imágenes se adquieran de forma consistente

Se recomienda tomar imágenes bajo las mismas condiciones al comparar imágenes.

Anota el modo de imagen, el tipo de fuente de luz, el filtro, el tiempo de exposición, el contenedor, el enfoque, la posición de la muestra, los ajustes de análisis y la corrección de fondo y cualquier corrección de fondo. Si es necesario, reutiliza los protocolos que se guarden.

Si se tiñe o destienda, asegúrate de que las condiciones sean las mismas para los geles de ácidos nucleicos y proteínas. Controla la carga de las muestras de control, la concentración de los anticuerpos, el tiempo del sustrato y el manejo de la membrana en Western blots.

El generador de imágenes solo podrá registrar la muestra en la que se coloca. No puede arreglar transferencias desiguales, demasiado fondo, líneas sobrecargadas ni la falta de especificidad de anticuerpos.

Prueba el software de análisis

Las tareas comunes no deberían ser difíciles de realizar con software de análisis de imágenes, y el software no debería obstruir la producción del resultado.

Algunas funciones interesantes podrían ser:

• Detección de carriles y bandas
• Estimación del peso molecular
• Resta de fondo
• Medición de intensidad de banda
• Advertencias de saturación
• Normalización
• Visualización de canales multiplex
• Anotación de imagen
• Exportación de datos
• Cuando el usuario o el experimento se graba.

El análisis integrado es una ventaja para el trabajo rutinario, y el software de escritorio puede ser más adecuado tanto para análisis detallados como para la preparación de figuras finales. Por ejemplo, los sistemas de imagen termoFisher ofrecen adquisición y análisis a bordo, así como flujos de trabajo de software externos.

Mantén el archivo de imagen original tal cual siempre mientras puedas. Para ajustar, la imagen mostrada no debería sustituir los datos en bruto de adquisición.

Asegúrate de tomar precauciones y tomar medidas adicionales para garantizar la seguridad de tus muestras

Es importante proporcionar un blindaje adecuado, ya que la luz ultravioleta directa o reflejada emitida por el dispositivo de imagen UV puede causar daños en los ojos y la piel. La exposición puede reducirse encerrando la cámara de imagen, que es menor en comparación con la caja de luz UV abierta.

Si se va a extraer el ADN del gel, el uso de excitación con luz azul podría ser mejor para las tinciones adecuadas de ácidos nucleicos. La imagen de luz blanca elimina el uso de UV para ver las tinciones proteicas visibles.

El sistema también debe diseñarse para garantizar que se evite la contaminación entre muestras. Lava las bandejas de muestras, elimina los derrames de tampón lo antes posible y sigue las directrices del fabricante para la limpieza de filtros, lentes y superficies de imagen.

Asegúrate de que el Sistema esté configurado como un Instrumento Óptico

El generador de imágenes de biología molecular no puede limpiarse solo de vez en cuando.

Las fuentes de luz se desgastan con el tiempo, los filtros pueden rayarse, las bandejas de muestras pueden mancharse y el polvo puede afectar la calidad de imagen. Los laboratorios deben registrar la iluminación, revisar bandejas y filtros, tomar copias de seguridad de los protocolos de adquisición, actualizar cuidadosamente el software y mantener la documentación del mantenimiento.

Cuando la calidad de imagen no sea buena, revisa todo el proceso y comprueba si hay algún problema con la cámara o con el resto de la cadena. Esto puede deberse a la tinta, la muestra o el sustrato, los ajustes de exposición, la fuente de luz o el filtro.

Conclusión

La plataforma más útil no siempre es la que tiene más funciones. Es el que ofrece la iluminación, sensibilidad, rango dinámico, software, área de imagen y flujo de trabajo adecuados que otros usuarios pueden reproducir.

Su buena imagen comienza desde la etapa de preparación de la muestra. El instrumento registra el experimento, pero si la preparación del ensayo se realiza cuidadosamente y la adquisición se repite, entonces la imagen (registro) tiene sentido.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Qué puede capturar un sistema de imagen de biología molecular?

Es capaz de capturar geles de ADN y ARN, geles proteicos, western blots quimioluminiscentes, western blots fluorescentes y membranas colorimétricas según el contexto.

P2. ¿Cuál es la diferencia entre un Sistema de Documentación de Gel y un Western Blot Imager?

No siempre. El sistema de gel básico puede soportar solo imágenes con luz UV, azul y blanca, y los imágenes Western blot pueden requerir quimioluminiscencia sensible o detección de fluorescencia multicanal.

P3. ¿Por qué es importante el rango dinámico? ¿Por qué es importante el rango dinámico?

Un amplio rango dinámico de señales permitirá capturar las más débiles y fuertes sin saturar las más fuertes. Esto es especialmente cierto en el análisis cuantitativo.

P4. ¿Se puede confiar en la exposición automática?

Puede ser útil determinar un rango de exposición inicial. El operador también debe observar otros factores como la saturación, el fondo, señales débiles y el modo de imagen.

P5. ¿Cuál es el mejor modo de imagen?

El modo utilizado depende de la muestra, tinción, etiqueta y objetivo de análisis. La fuente de luz, el filtro y los ajustes de la cámara dependen del ensayo.