Sistema ultrasónico de fragmentación del ADN: ¿Qué hace que el cizallamiento del ADN sea reproducible?

Romper ADN no es gran cosa.

Lo importante es descomponerlo en una distribución de fragmentos útil y repetible, de una muestra a otra, de un día a otro.

Por tanto, la capacidad de cortar ADN genómico no debería ser el único criterio utilizado para evaluar un sistema ultrasónico de fragmentación de ADN. En cambio, la cuestión para un laboratorio NGS es si una muestra puede definirse claramente y colocarse en el instrumento hoy, la próxima semana o en manos de otro laboratorio y aun así avanzar hacia la preparación de la biblioteca sin necesidad de replantearse todo el proceso.

En lugar de ser un proceso de sonicación independiente, la fragmentación acústica controlada forma parte de Longlight. Cizallamiento de ADN/ARN que está diseñado para la preparación de muestras NGS. Esta distinción puede resultar útil a la hora de diseñar una técnica que debe adaptarse al trabajo diario de laboratorio.

Siempre empieza con el Perfil de Fragmento y NO con la configuración de potencia.

No es el objetivo del experimento ajustar el instrumento.

El objetivo es la población de ADN que se extrae del tubo.

La definición de lo que se espera aguas abajo del flujo de trabajo de la biblioteca es el primer punto de partida y luego trabajar hacia atrás hasta un protocolo acústico. Un ajuste que genera una distribución beneficiosa para un array de ADN no debería considerarse un protocolo universal para otros arrays.

Esto es especialmente crítico en el caso de la transferencia de métodos. Es fácil duplicar un programa de sonicación de un experimento anterior y considerar el trabajo hecho. La concentración de la muestra, el volumen de la muestra, el estado del ADN, el tipo de tubo y el historial de procesamiento forman parte del método en la práctica.

Por tanto, el sistema debe validarse en torno a la muestra real, en lugar de alrededor de un número atractivo mostrado en la pantalla del contador.

El ADN llega al Sonicator con un pasado.

El "ADN genómico" presente en dos tubos no es necesariamente una entrada igual.

Se puede incluir ADN de alto peso molecular de una extracción limpia. Otro podría haber experimentado almacenamiento, manipulación múltiple o un proceso de purificación antes del inicio de la fragmentación.

Eso es importante porque el paso de corte es un paso intermedio en un paso más grande.

Los laboratorios deben identificar primero variables controlables (volumen de muestras, rango de concentración de ADN, tipo de recipiente, condición de temperatura y protocolo de manipulación) antes de optimizar un protocolo de fragmentación ultrasónica del ADN. Si no, la avería puede manifestarse varios pasos aguas arriba como un aparente problema de instrumentos.

En casi todos los casos de ultrasonido enfocado, la energía se aplica al objetivo.

El método tradicional de sonicación tiende a hacer que los investigadores consideren principalmente la cantidad de ultrasonidos que se están creando. La otra pregunta sobre la ultrasonicación enfocada es: ¿A dónde va esa energía acústica?

Los sistemas BoFU de Longlight no requieren que se inserte una sonda en la muestra biológica, sino aspectos de energía acústica enfocada dentro de un medio acústico. Utiliza procesamiento sin contacto y control integrado de temperatura, su Ultrasonido focalizado BoFU-100 se dice que está diseñado para el corte de ADN, ARN y cromatina, y para la fragmentación del genoma, para NGS.

Esa disposición cerrada y sin contacto es conveniente para la fragmentación del ADN, ya que la muestra no requiere contacto directo con una sonda de sonicación. También minimiza las variables de contacto con la muestra y la limpieza que de otro modo se incorporarían en el protocolo.

No es necesariamente "más ecografía".

Es una administración más controlada de la ecografía.

¡La temperatura forma parte del Método de Fragmentación!

El calor es un factor fácil de pasar por alto porque no es una variable separada en el último archivo de secuenciación.

Sin embargo, las condiciones térmicas durante la sonicación forman parte del entorno de procesamiento de muestras. Si el historial de temperatura es diferente para una ejecución que para la otra, entonces el protocolo se está reproduciendo de forma diferente.

Por eso es importante pensar en la gestión de la temperatura antes del proceso de diseño antes que en la acústica, y no como un equipo.

Los diseños de ultrasonicadores enfocados de Longlight incluyen procesamiento de muestras a baja temperatura y temperatura constante y detección integrada para controlar el calor generado durante el tratamiento con ultrasonicador.

Para el desarrollo de métodos, es decir, registrar condiciones relacionadas con la temperatura, tan seriamente como el propio programa de sonicación.

¿Qué significa "reproducible" con el rendimiento de rendimiento?

Lo que va bien con un solo tubo será engorroso si llegan 20 o 40 muestras antes de comer.

Así que en ese punto es más un problema de rendimiento.

Las muestras pueden conservarse durante distintos tiempos antes del procesamiento. Los operadores podían introducir ajustes varias veces. Puede haber variaciones entre los tipos de ejemplares. Un flujo de trabajo así, en el que se requiere mucho trabajo manual y repetitivo, puede causar variación incluso si la tecnología acústica en sí es estable.

Longlight's Ultrasonicador Enfocado BoFU-800 tiene la capacidad de procesar entre 1 y 8 muestras, con condiciones que pueden optimizarse y ajustes por lotes que se pueden aplicar si se procesan varias muestras simultáneamente.

El Ultrasonido focalizado BoFU-1600 está diseñado para manejar muestras en lotes más grandes con 16 posiciones de muestra y la capacidad de procesar individualmente o en lote.

La pregunta importante sobre las compras es, por tanto, "¿Qué sistema tiene más posiciones?"

Es decir, "¿cuántas muestras se procesan realmente juntas y con qué frecuencia requieren esas muestras protocolos diferentes?"

Observa más que el tamaño medio de un fragmento

Una muestra exitosa de ADN no convierte en un flujo de trabajo de fragmentación del ADN exitoso.

Una ejecución de validación no debería ser la más limpia, sino que span replica y batch. Los científicos deberían considerar si la distribución de fragmentos sigue siendo adecuada, si existen colas inusuales o si la distribución de fragmentos se hace más amplia, y si la preparación de la biblioteca aguas abajo funciona de forma consistente.

Este es también el momento en que el laboratorio debe decidir cómo se revisará rutinariamente la calidad de los fragmentos.

La QC solo se realiza durante el desarrollo del método y no se utiliza para el procesamiento rutinario; pequeños cambios pueden acumularse antes de que alguien pueda detectarlos.

La intención no es demostrar la capacidad del sonicador para fragmentar ADN una sola vez.

La idea es crear un proceso que sea repetible.

Selecciona el instrumento alrededor del banco, no alrededor del folleto.

Cada laboratorio tendrá su propio factor limitante.

Un pequeño grupo de investigación que haga algunas muestras de ADN, ARN o cromatina ocasionalmente podría apreciar un flujo de trabajo integrado pequeño. Un laboratorio de secuenciación que realiza múltiples muestras simultáneamente puede estar más interesado en el procesamiento paralelo. Puede requerir más rendimiento y configuraciones repetibles/rastreables entre los operadores dentro de una instalación central.

Por esta razón, no es posible seleccionar el sistema adecuado solo con la base de la tecnología acústica.

Según el propio Longlight Preguntas frecuentes sobre ultrasonicadores enfocados, en lugar de elegir solo una especificación, se consideran factores como el control acústico-energético, la consistencia del tamaño del fragmento, el rendimiento, la compatibilidad de válvulas, el mantenimiento, el presupuesto de servicio y el presupuesto del laboratorio.

Comprobación final de validación

Antes de incorporar un sistema ultrasónico de fragmentación de ADN en tu protocolo normal de preparación de NGS, plantea algunas preguntas prácticas.

¿Es posible obtener el perfil de fragmentos deseado en laboratorio en más de una muestra? ¿Se especifican condiciones de entrada? ¿Se controla la temperatura? ¿Es apropiado el formato del tubo o muestra para el protocolo? ¿Es posible lograr un mayor rendimiento sin introducir ninguna variación manual superflua?

Si las respuestas a esas preguntas son obvias, entonces el paso de sonicación para crear un genoma fragmentado ya no se trata tanto de un paso de sonicación independiente, sino más bien de lo que se supone que debe ser: una transferencia controlada a la preparación de la biblioteca.

Preguntas más frecuentes

P1. ¿Qué es el sistema ultrasónico de fragmentación del ADN?

Corta mecánicamente el ADN en fragmentos más pequeños, a energía acústica controlada, para su uso en flujos de trabajo como la preparación de bibliotecas NGS. Esta energía puede transmitirse mediante un sistema enfocado a través de un medio acústico sin necesidad de tocar la muestra con la sonda.

P2. ¿Se puede realizar la fragmentación del ADN con NGS mediante ultrasonicación enfocada?

Sí. Según una lista publicada por Longlight, la fragmentación genómica para NGS es una de las aplicaciones de los sistemas ultrasonicadores enfocados en BoFU de Longlight. Todavía hay algunas condiciones de protocolo que deben optimizarse para la muestra y el flujo concretos.

P3. ¿Más potencia ultrasónica significa mejor?

No. El objetivo no es necesariamente la máxima energía acústica, sino la distribución reproducible de fragmentos que pueda utilizarse para un procesamiento posterior posterior. La configuración debe depender del estado de la muestra y del protocolo.

P4. ¿Por qué es importante controlar la temperatura durante el corte de ADN?

La naturaleza del proceso ultrasónico es que se genera calor, haciendo de la temperatura un parámetro de procesamiento. La condición térmica controlada es importante para mantener las secuencias comparables cuando se repiten usando el mismo método de fragmentación.

P5. ¿Cuál de los distintos sistemas de rendimiento debería elegir?

Comienza considerando el número de muestras que normalmente se procesan a la vez y si las muestras deben procesarse bajo las mismas o diferentes condiciones. BoFU-800 puede acomodar entre 1 y 8 procesamientos de muestras y BoFU-1600 tiene 16 posiciones de muestra para flujos de trabajo más grandes.