Buffer de electroforesis ultrarrápido: Geles de ADN más rápidos sin perder claridad

Aunque la electroforesis en gel de agarosa es sencilla y fiable, el tiempo para la electroforesis convencional a veces es un factor limitante en un laboratorio de biología molecular muy activo. Si un laboratorio realiza varias reacciones PCR, digestiones por restricción o clonación de muestras al día, una operación de 30 minutos puede convertirse en un cuello de botella significativo cuando se procesan varios geles cada día.

Se formula un buffer de electroforesis ultrarrápido con menor fuerza iónica, que reduce la conductividad y la corriente a una determinada intensidad de campo eléctrico y, por tanto, limita el calentamiento en Joule. Esto permite utilizar mayores intensidades de campo bajo condiciones validadas, acortando el tiempo de separación y manteniendo una resolución útil de bandas.

Ultra Rápido Electrophoresis Buffer—¿Qué es?

Un tampón de electroforesis ultra rápida es un tampón de electroforesis de baja fuerza iónica optimizado para la separación rápida de fragmentos de ADN en geles de agarosa. Suministra los iones necesarios para la conductividad eléctrica y para las condiciones químicas durante la migración.

La fuerza iónica de este buffer es menor que la de la mayoría de los buffers tradicionales, por lo que se genera menos calor en una condición de funcionamiento dada debido a la corriente. Esto puede permitir el uso de un gradiente de tensión más alto en el laboratorio y acortar el tiempo de funcionamiento.

Longlight's Búfer de funcionamiento súper rápido 50X se proporciona como solución concentrada y acortará el tiempo de separación de los típicos 30 minutos a unos 5-10 minutos según las condiciones recomendadas.

La razón Inferior ¿La fuerza iónica puede aumentar la velocidad de carrera?

El ADN tiene carga negativa y migra hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Cuanto mayor es el campo eléctrico, más rápido viaja el ADN; sin embargo, los buffers convencionales pueden producir calor significativo a campos eléctricos altos.

El sobrecalentamiento puede hacer que la agarosa se derrita, provocando vías dobladas, bandas curvas o daños en el equipo de electroforesis. Un buffer de baja fuerza iónica resulta en menos corriente; se genera menos calor, lo que hace más factible operar a voltaje más alto.

Esto no significa que el voltaje pueda aumentarse indefinidamente. Las dimensiones del gel, la profundidad del buffer, el diseño de la cámara y la temperatura ambiente y la capacidad de alimentación siguen afectando a la funcionalidad.

Will Faster Electrophoresis ¿resultar en menos resolución?

Cuando el buffer, la concentración de agarosa, el voltaje y la distancia de la tirada son apropiados a la muestra, se puede lograr una buena separación con una tirada rápida. Las condiciones normalmente no se comprueban cuando se transfiere un método, lo que resulta en una mala resolución.

Para que los fragmentos se separen, deben tener suficiente distancia de migración si son de tamaño similar. Si la secuencia se detiene demasiado pronto, pueden comprimirse, incluso si se observa que el tinte de seguimiento se ha movido cerca de los pozos.

Es importante que los laboratorios reconozcan la diferencia entre un análisis para determinar la presencia o ausencia y un gel analítico de alta resolución. El primero puede necesitar un tiempo de gel más corto, y el segundo puede requerir un tiempo de gel más largo o un voltaje ligeramente menor.

Cómo preparar un buffer funcional 1X a partir de un concentrado 50X?

El concentrado 50X debe diluirse hasta obtener una solución de trabajo 1X. Por ejemplo, para hacer 1 L de tampón de trabajo 1X, mezcla 20 mL de concentrado 50X con 980 ml de agua destilada o desmineralizada.

Agita bien antes de colar o llenar la cámara. Tanto para la preparación del gel de agarosa como para el tanque, usa la misma preparación 1X para mantener la consistencia en la conductividad del sistema.

No diluyas el buffer por debajo de la concentración de trabajo recomendada para reducir aún más la corriente. Un buffer débil y/o patrones de bandas inconsistentes pueden resultar de una concentración incorrecta que puede llevar a una migración anormal.

¿Qué es el Correcto ¿Voltaje para ajustar?

El voltaje debe determinarse por la longitud efectiva del gel, y no simplemente seleccionarse de un sistema familiar en una fuente de alimentación. Longlight recomienda el uso de unos 25–30 V/cm de longitud de gel con su buffer de funcionamiento rápido.

Pero el ajuste final también debe tener en cuenta la cámara de electroforesis y el tipo de gel y temperatura del tampón. El voltaje final también debe tener en cuenta la longitud del gel, la carga de la muestra, el diseño de la cámara y la temperatura del tampón.

La fuente de alimentación debe ser estable en la salida en el ajuste deseado. El Fuente de alimentación por electroforesis EP-600 fabricado por Longlight está diseñado para proporcionar un suministro estable de energía por electroforesis para el laboratorio.

¿Qué Gel Condiciones ¿No han cambiado?

El tampón no puede superar el uso de una concentración de agarosa que no sea adecuada. La menor concentración de agarosa tenderá a soportar los fragmentos de mayor peso molecular, y cuanto mayor sea la concentración de agarosa, mejor será la separación de fragmentos más pequeños de ADN.

El grosor del gel también es importante. Los geles gruesos pueden tardar más en teñirse y pueden tener más calor. Formación limpia de pozos y carga de muestras sin dañar los bordes.

Una cámara horizontal compatible permite igualar las condiciones eléctricas. El Sistema de gel horizontal HE-50 es compatible con múltiples sistemas de gel y presenta un diseño de cámara de bajo consumo de tampón.

¿Qué métodos de tinción y visualización usar para el ADN?

Dependiendo del producto y el protocolo, se puede incorporar una tinción de ácido nucleico durante la preparación del gel o aplicarse tras la electroforesis. Al comparar un tampón rápido con un método de tinción existente, el método de tinción debe ser el mismo.

Tiradas muy cortas pueden afectar la percepción de la intensidad de la tinción, especialmente si las bandas son de corta distancia. Es importante ajustar la exposición, por lo que, como consecuencia de lo anterior, no copiar la exposición automática de una tirada convencional.

LongLight's RedView Tinción de ácido nucleico puede utilizarse para visualizar ADN y ARN en geles de agarosa y poliacrilamida y funciona con equipos de imagen comunes.

¿Es eso Posible ¿para recuperar ADN tras una rápida prueba?

Sí, siempre que el tampón y la tinción no tengan efecto en la extracción del gel ni en las reacciones posteriores. Según Longlight, 50X Super Fast Running Buffer no afecta a la extracción o ligadura de gel de ADN.

Minimizar exposiciones innecesarias a la luz UV y eliminar la mayor cantidad posible de gel para una mejor recuperación. La banda debe mantenerse separada para que sea lo suficientemente distinta y no se incluya ningún producto vecino.

Cuando la validación de un método es para clonación, secuenciación u otro proceso sensible posterior, se evalúa el rendimiento, pureza y rendimiento del ADN recuperado.

¿Cuándo cambiar el buffer de ejecución?

Algunos buffers pueden reutilizarse, pero la reutilización debe controlarse y no solo en función de la apariencia. Con pasajes repetidos, la temperatura, la distribución de iones y el rendimiento del buffer pueden alterarse.

Si la migración se ralentiza, las bandas no tienen la forma esperada o la solución se contamina, se sustituye el buffer. Otra razón para comprobar el buffer es que la temperatura ambiente es alta y tras pasadas rápidas seguidas.

Si la muestra es importante o tiene una entrada baja, se recomienda utilizar un buffer de trabajo nuevo para evitar variaciones innecesarias.

¿Cuáles son los pasos adecuados para que el laboratorio valide el Switch?

Utiliza una escalera de ADN conocida y muestras. Utiliza la misma concentración de gel, volumen de muestras y método de tinción en el tampón existente y el tampón ultrarrápido, y pásalos en paralelo.

Iguala el tiempo de ejecución, la forma de la banda, la separación de fragmentos cercanos y la consistencia de migración y calidad de imagen. Cuando la extracción en gel esté involucrada en el flujo de trabajo, evalúa también el rendimiento de la extracción en gel y una reacción posterior.

Una vez aceptado, documenta la dilución, el gradiente de voltaje, el tamaño del gel, la longitud del tirado, cómo se teñió el gel y cuántas veces se utilizó el buffer. Longlights reactivos generales y consumibles están diseñados para facilitar aplicaciones regulares en genómica y biología molecular.

Conclusión

El tampón de electroforesis ultra rápido puede transformar el análisis de gel de agarosa en una comprobación de calidad rápida. La ventaja es que permite una menor fuerza iónica y, sin embargo, una mayor intensidad de campo eléctrico utilizable.

Sin embargo, todos los aspectos de la preparación 1X, la adaptación de tampón en gel y funcionamento, la concentración de agarosa y el control de temperatura siguen siendo cruciales para garantizar resultados fiables. Una validación corta lado a lado permite a los laboratorios acortar el tiempo de funcionamiento sin sacrificar la separación de bandas interpretables.

Preguntas más frecuentes

Q1. ¿Se puede usar un tampón de electroforesis ultra rápida con un gel de ADN?

Sí. Diseñado para una separación rápida del ADN en el gel de agarosa. Se recomienda a los usuarios verificar la compatibilidad de la cámara del gel, la tinción y el flujo de trabajo posterior.

Q2. ¿Está listo el buffer 50X para usar?

No. Un concentrado de 50X debe diluirse a 1X antes de la preparación en gel o la electroforesis. Usar el concentrado directamente resultaría en una fuerza y conductividad iónica excesivamente altas, lo que conduciría a una generación excesiva de corriente y calor durante la electroforesis.

Q3. ¿Se usan los mismos buffers para el lanzamiento y para el gel de pasar?

Sí, se recomienda el mismo lote de tampón de trabajo 1X para ambos. Esto ayuda a mantener la fuerza del tampón en todo el sistema de gel.

Q4. ¿El gel se calienta si se sube el voltaje?

Si no se amortigua adecuadamente, puede no ser adecuada la tensión o las condiciones de la cámara. Para múltiples corridas y/o laboratorios calientes, monitoriza la temperatura del tampón.

Q5. ¿Es posible recuperar ADN de una separación electroforética rápida para la ligadura?

Sí, si se utiliza una tinción y un tampón adecuados. La validación inicial del laboratorio debe abarcar la recuperación y el rendimiento de la ligadura.