Cómo un ultrasonicador de cizallamiento de ADN entrega fragmentos listos para NGS en minutos

Un Ultrasonicador de Cizallamiento de ADN fiable es la base de la preparación consistente de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS); La calidad de la fragmentación determina directamente la uniformidad de cobertura, la precisión de las llamadas de variantes y la complejidad de la biblioteca, moldeando cada análisis posterior. A medida que las plataformas de secuenciación avanzan y aumenta el rendimiento de la muestra, los laboratorios necesitan instrumentos que mantengan la integridad de la muestra mientras producen distribuciones reproducibles del tamaño de los fragmentos.

Optimización de técnicas de fragmentación del ADN para

Maximizar la uniformidad de la cobertura de genes clínicamente relevantes mediante secuenciación del genoma completo

Los actuadores ultraónicos enfocados (FUA) utilizan el Ultrasonicador enfocado BoFU-800 de Longlight Technology para satisfacer las necesidades de los laboratorios. Por primera vez, los laboratorios pueden tener fragmentos de ADN listos para NGS en cuestión de minutos.

La importancia de la NGS y el valor de un cizallamiento eficiente del ADN

Contrariamente a la creencia común, la fragmentación del ADN no es el primer paso en un proceso de procesamiento. La calidad de los datos producidos es un resultado directo de los fragmentos de tamaño que se producen. Lograr una cobertura suficiente de variantes de baja frecuencia debería ser alrededor de una distribución de Poisson. La fragmentación del ADN debe ser lo suficientemente precisa como para contribuir a una biblioteca de mayor densidad, y las variantes distribuidas de Poisson no deben confundirse con variaciones en el número de copia que surgen de puntos de ruptura de cobertura bajos.

Aunque el coste inicial de la fragmentación enzimática es significativamente menor, el sesgo de secuencia es más común. Estos sesgos tienden a producir más variación en los datos recogidos. Numerosos estudios realizados por Discovery Life Sciences demuestran que se obtuvo un tamaño más consistente para los fragmentos mediante métodos de cizalladura de fragmentación del ADN a partir de muestras de FFPE de baja entrada. Para flujos de trabajo en entornos de laboratorio con un volumen de muestra muy bajo o donde la preservación de la muestra es una preocupación, esta previsibilidad de la fragmentación mecánica es una ventaja clara.

Un ultrasonicador enfocado en cizalladura de ADN frente a sonicadores tradicionales

Un ultrasonicador de cizallamiento de ADN enfocado utiliza ultrasonidos de alta frecuencia enfocados sobre la muestra. En contraste, los sonicadores convencionales de tipo sonda y baños maria utilizan energía dispersa y necesitan contacto directo con muestras.

Un ejemplo de este sistema incluye el BoFU-800 y su uso de tecnología de ultrasonido confocal, lo que llevó a lo siguiente.

1. Fragmentación controlada y repetible: la incidencia del pico y el ancho del pulso puede ajustarse al ADN a fragmentar, por ejemplo, en rangos de 300 a 600 bp para la secuenciación del genoma completo (WGS), o de 250 a 350 bp para la secuenciación del exoma completo (WES).

2. Procesamiento de muestras sin contacto: no es necesario extraer las muestras de tubos de alta calidad presellados, manteniéndose herméticos y herméticos para garantizar que la muestra o cualquier material nuclear valioso que contenga no se estropee.

3. Operación verdadera a baja temperatura: el sistema de condensación es de alta calidad, lo que conduce a un balance isotérmico in situ sin la cadena de eventos de reacciones endotérmicas ni la clarificación causada por la alta temperatura en la muestra sujeta a la explosión extremadamente alta de energía.

Cuando la potencia máxima de incidencia se calibra adecuadamente, se pueden alcanzar fragmentos tan pequeños como 120-150 pb de forma reproducible entre múltiples muestras. El BoFU-800 puede procesar de 1 a 8 muestras simultáneamente, con ajustes de condición independientes por pozo o modo lote para una uniformidad en un solo clic, lo que proporciona flexibilidad a los laboratorios sin sacrificar la consistencia.

De la muestra a la secuenciación-Lista para la biblioteca en minutos

La eficiencia en tiempo es imprescindible en un entorno de laboratorio muy concurrido. Un ultrasonicador de cizallamiento de ADN de última generación puede mejorar enormemente la eficiencia del flujo de trabajo:

• Reducción del tiempo de interacción: El BoFU-800 viene con un sistema operativo integrado, lo que significa que ya no se requiere un ordenador externo y se reduce el desorden en el laboratorio.

• Flexibilidad en procesamiento en tiempo real: El modo libre permite el tratamiento individual de cada muestra, mientras que el modo de procesamiento por lotes aplica los mismos parámetros para todo el lote para un procesamiento eficiente en tiempo.

• Preparación rápida para el análisis de fragmentos: Los tamaños estrechos y consistentes de fragmentos producidos por ultrasonicación enfocada eliminan la necesidad de un paso de preparación de la biblioteca que consume mucho tiempo.

En entornos con procesamiento clínico de muestras y tiempos de respuesta medidos en días, no semanas, todo lo anterior equivale a resultados de casos de laboratorio más rápidos. El dispositivo cuenta con drenaje automatizado con eliminación de residuos con un solo clic, un sensor de nivel de agua integrado con sistema de alerta temprana y un ciclo de funcionamiento eficiente en tiempo, reduciendo el tiempo de inactividad de lotes y aumentando el tiempo de funcionamiento continuo hasta el tamaño de las subunidades.

Compatibilidad con Difícil y Bajo-Muestras de entrada

Un verdadero Ultrasonicador de Cizallamiento de ADN aprovecha características únicas de procesamiento de muestras cuando este es difícil. Los tejidos FFPE, las biopsias líquidas y las muestras clínicas degradadas, entre otras, presentan el procesamiento de muestras más difícil y desafiante disponible para un laboratorio moderno. Los métodos tradicionales de extracción y cizallamiento de muestras no son racionalmente transportables ni adoptables frente a la extrema variabilidad y los desafíos de procesamiento de muestras, lo que conduce a tamaños de fragmentos poco prácticos y defectuosos, o al fallo de toda la preparación de la biblioteca.

La ultrasonicación enfocada ayuda a aliviar estas preocupaciones. Cuando se combina con protocolos de extracción, la extracción mejorada acústica proporciona mejores métricas de calidad a partir de muestras archivadas de FFPE en comparación con los métodos convencionales basados en columnas. El BoFU-800 extiende la funcionalidad al propio paso de cizallamiento:

• Baja compatibilidad de entrada: El sistema corta eficazmente el ADN para aplicaciones de pequeño volumen, logrando una alta capacidad de recuperación.

• Deparafinización de tejido FFPE y extracción de ADN: El mismo principio de ultrasonido enfocado ayuda al flujo de trabajo desde bloques de tejido tumoral y muestras de biopsia líquida.

• Cizallamiento de cromatina para ChIP-seq: Además del cizallamiento de ADN, el dispositivo puede utilizarse para la inmunoprecipitación de cromatina, proporcionando funcionalidad para la investigación epigenética del laboratorio.

• La capacidad del sistema para cortar paredes celulares resistentes y preservar analitos aguas abajo mejora la eficiencia de los investigadores que utilizan hongos filamentosos o MALDI-TOF MS para la identificación de Mycobacterium.

¿Cómo se logra una preparación exitosa de una biblioteca para muestras de baja calidad y baja entrada?

¡La tecnología de preparación de bibliotecas de un solo hilo aumenta significativamente la tasa de éxito!

El procesamiento por lotes y el conjunto de funcionalidades de resultados reproducibles del BoFU-800 ofrecen soluciones flexibles para la preparación automatizada de bibliotecas como componente esencial de la secuenciación predecible de extremo a extremo.

Los instrumentos de lectura larga necesitan fragmentos de 10 kbp o más sin sesgo. La investigación ha explorado el uso de perlas para lograr un corte de 10-20 kbp para la secuenciación de moléculas individuales. El BoFU-800 está optimizado para cizallamiento en el rango de 150-600 bp, pero la acústica enfocada también ofrece el potencial de que el cizallamiento mecánico escale con la secuenciación.

Un ultrasonicador de cizallamiento de ADN que abarca amplios rangos de cizallamiento proporciona al laboratorio la flexibilidad para atender aplicaciones diversificadas.

Construcción de un flujo de trabajo NGS consistente

En genómica, la mejor moneda que se puede tener es la reproducibilidad. Desafortunadamente, cada método de preparación de biblioteca expone a los laboratorios a cierto grado de variabilidad técnica. El objetivo de toda empresa tecnológica es diseñar sus dispositivos para reducir la variabilidad al mínimo indispensable. Un ultrasonicador de cizallamiento de ADN calibrado de fábrica (con construcción correcta) te beneficia por:

1. Uso fiable del instrumento: Dado que todos entregan la misma cantidad de energía por pozo de muestra, todos los seguros de Ultrasonicator son calibraciones de fábrica únicas.

2. Historial de procesamiento de muestras: El ultrasonicador documenta los parámetros y condiciones de procesamiento, y da al operador la capacidad de acceder a total transparencia de datos experimentales y preparación para auditorías.

3. Minimización de la variabilidad del operador: Debido al procesamiento por lotes y al riesgo de variabilidad del operador, se elimina.

Estas características no son simplemente mejoras de comodidad; Son requisitos previos para pasar de la investigación a escala de descubrimiento a aplicaciones de diagnóstico reguladas, donde la consistencia entre lotes y operadores es obligatoria.

Conclusión

La genómica moderna exige mayor rendimiento, menor entrada y un control de calidad más estricto. Un ultrasonicador de cizallamiento de ADN como el BoFU-800 entrega fragmentos listos para NGS en minutos mediante energía acústica enfocada, procesamiento sin contacto y control de temperatura real en un diseño compacto y adaptado para lotes. Al permitir una fragmentación consistente entre 1 y 8 muestras y apoyar aplicaciones desde la extracción con FFPE hasta el cizallamiento de cromatina, el BoFU-800 ayuda a los laboratorios a lograr la reproducibilidad y eficiencia que requieren resultados fiables de NGS: menos resolución de problemas, más descubrimiento.

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Preguntas frecuentes

P: ¿Puede el BoFU-800 cortar ADN rápidamente para NGS?

R: La velocidad de fragmentación depende de la muestra. La mayoría de las muestras se fragmentan hasta el rango objetivo entre 150 y 600 pb en solo unos minutos.

P: ¿Se pueden dañar las muestras por calentamiento al usar la ultrasonicación enfocada?

R: El BoFU-800 intenta controlar la temperatura para que sea isotérmica. Así, las muestras no se dañan por el calentamiento.

P: ¿Puedo procesar muestras con condiciones variables en una sola prueba?

R: Sí. El modo libre permite establecer los parámetros para los 8 pozos de forma independiente, mientras que el modo por lotes establecerá los mismos parámetros para todos los pozos.

P: ¿Se puede usar el BoFU-800 con muestras de baja entrada o con FFPE? R: Sí. La acústica enfocada es capaz de usar incluso 1 ng de ADN. El uso de tubo cerrado también es útil para la conservación de muestras extraídas de FFPE.

P: ¿Necesito tener mi propio ordenador para manejar el dispositivo?

R: No. El BoFU-800 tiene un sistema operativo integrado, así que no necesitas un ordenador extra. Por eso, se ocupa menos espacio en el banco para la configuración.