Receptor acoplado a proteínas G: de la señalización celular al descubrimiento de fármacos

Los receptores acoplados a proteínas G, o GPCRs por sus siglas en inglés, son proteínas de membrana que ayudan a las células a responder a señales externas a las células. Estas señales pueden incluir hormonas, neurotransmisores, lípidos, péptidos, así como la luz.

Aunque existe una clara similitud de estructura en la estructura de siete transmembranas de los GPCR, no funcionan de la misma manera. Los resultados de un experimento pueden depender del ligando del receptor, el entorno de la célula, el nivel de expresión del receptor y los socios de señalización.

Por tanto, los investigadores deben ir más allá de esta medición de la "activación" de un receptor por parte de un compuesto para descifrar la biología de la GPCR. Toda la ruta, el tiempo, el formato del ensayo, los controles y el modelo de la célula son importantes.

Receptor acoplado a proteínas G: ¿Qué es?

El número de veces que un GPCR típico atraviesa la membrana celular es 7. Las partes extracelulares se unen a moléculas de señalización y las porciones intracelulares se unen a las proteínas G, arrestinas, quinasas y otras moléculas de señalización.

Los GPCR se clasifican en varias clases principales según la Guía de Farmacología de IUPHAR/BPS, como receptores de Clase A, Clase B, Clase C, Frizzled y Adhesión. La clase A es la más grande e involucra objetivos bien conocidos, como los receptores adrenérgicos, dopaminos, opioides y muscarínicos.

Aunque son similares en estructura, los GPCR son capaces de reconocer un conjunto muy diverso de señales. Esto les permite participar en la percepción sensorial, la regulación cardiovascular, el metabolismo, las funciones inmunitarias, el estado de ánimo, el movimiento y mucho más.

¿Cómo se activan los GPCR?

Un ligando se une al receptor y hace que el receptor cambie de forma. Como resultado de este cambio conformacional, el receptor es capaz de interactuar con una proteína de señalización intracelular.

Muchos GPCR tienen como primer socio una proteína G heterotrimérica compuesta por subunidades alfa, beta y gamma. La activación de los receptores resulta en el intercambio de GDP por GTP en la subunidad alfa. Los componentes activados afectan entonces a las enzimas posteriores, canales iónicos y segundos mensajeros.

Las familias más populares de proteínas G son:

• Gs, que normalmente provoca un aumento del AMP cíclico
• El nombre comúnmente utilizado para la enzima reductora cíclica de AMP es gi/o.
• La vía Gq/11 que señala las vías de fosfolipasa C y calcio
• Las respuestas de la proteína y del citoesqueleto de la familia Rho-pueden ser controladas por G12/13.

Esta descripción del libro de texto es útil, ¡pero una línea es una forma rara de señalización! Un solo receptor puede señalar a través de múltiples proteínas G y la transducción óptima de señales puede variar según el ligando y el tipo celular. GPCRdb menciona que los receptores pueden interactuar con proteínas G, quinasas GPCR y arrestinas, lo que conduce a la formación de diversas vías de señalización intracelular.

Los roles de los arrestados

Una vez activada la proteína G, la señalización de los GPCR no se detiene.

Las quinasas GPCR son capaces de fosforilar receptores activados. Las arrestinas podrían entonces interactuar con el receptor, inhibir un mayor acoplamiento del receptor con las proteínas G, facilitar la internalización del receptor y participar en otras vías de transducción de señales.

Por lo tanto, el reclutamiento de arrestos no puede considerarse un "interruptor de apagado". Dependiendo del receptor y del experimento, puede afectar al tráfico, desensibilización, reciclaje, degradación del receptor o modular otros efectos posteriores.

Dado que tanto la señalización de la proteína G como el reclutamiento por arrestina son medidas importantes de la farmacología completa de un compuesto, a menudo se miden conjuntamente.

Los artículos de esta sección examinan las formas en que el mismo receptor puede provocar diferentes respuestas

Los GPCR no son solo interruptores de encendido/apagado.

Se pueden encontrar varios ligandos que se unen a diferentes fases conformacionales del receptor. Un tipo de ligando puede causar altos niveles de activación en una vía de la proteína G, mientras que la otra puede provocar un mayor reclutamiento de arrestinas o un perfil de señalización diferente. Normalmente se denomina selectividad funcional/señalización sesgada.

Los antecedentes de las células también son importantes. El mismo receptor puede encontrarse en dos laboratorios diferentes, pero tiene diferentes cantidades de proteínas G, arrestinas, quinasas, enzimas o receptores endógenos en las células.

Otro problema puede ser el nivel de expresión de los receptores. Una expresión excesiva puede potenciar las respuestas a bajos niveles de actividad y/o alterar las preferencias de acoplamiento, y también puede llevar a que un agonista parcial tenga una actividad más fuerte en la célula que en el tejido nativo.

Por tanto, un resultado debe interpretarse como una indicación del comportamiento de un sistema experimental completo y no únicamente del receptor.

Selecciona el ensayo según la pregunta biológica

Ningún ensayo GPCR puede responder a todas las preguntas.

Ensayos cAMP

Los receptores con proteínas G o Gi suelen medirse usando cAMP. Una respuesta G podría provocar un aumento del cAMP y una respuesta Gi podría indicarse por la inhibición de la producción estimulada de cAMP.

Estos ensayos se utilizan comúnmente en estudios de concentración-respuesta, en estudios de caracterización de agonistas y en estudios de antagonistas. En los experimentos antagonistas, normalmente se aplica una concentración del agonista tras la exposición del compuesto de prueba a las células.

Ensayos de calcio

Los receptores acoplados a Gq pueden estudiarse mediante ensayos intracelulares de calcio. Pueden proporcionar una lectura rápida y de alto rendimiento, pero la respuesta puede ser corta y depender mucho del manejo de las células, la carga de los colorantes, la expresión de los receptores y el momento de la medición.

Enlace GTPγS

Los ensayos GTPγS son uno de los primeros eventos medidos en el proceso de activación de la proteína G y a menudo se utilizan para confirmar la actividad del agonista en preparaciones de membrana. Dado que el ensayo está bastante cerca de la interacción receptor–proteína G, puede reducir parte de la amplificación experimentada en las lecturas posteriores.

Arresto Reclutamiento

Los ensayos de arrestina pueden utilizarse para investigar el sesgo de las vías, la señal específica de ligandos, el tráfico de receptores y la desensibilización de receptores. Se usan mejor junto con un ensayo de proteína G y no como un indicador general de la activación de un receptor.

Biosensores de células vivas

Las técnicas BRET y FRET (y otros métodos de biosensores) pueden rastrear eventos de señalización en células vivas en función del tiempo. El mayor atractivo de la información es la información cinética: los investigadores pueden medir cuándo empieza la señalización, cuándo alcanza su pico y luego disminuye, ya que miden más de un punto final.

Haz un experimento GPCR preciso

Un buen ensayo se basa en el biológico y no en el instrumento.

Para empezar, asegúrate de que el receptor esté expresado y situado en la ubicación correcta de la membrana celular. La baja respuesta puede no deberse a la baja actividad del ligando, sino a una mala expresión o tráfico de receptores.

En segundo lugar, añadir dispositivos de control apropiados. Comúnmente, pueden ser necesarios un agonista conocido, un antagonista conocido, controles de vehículos, células no transfectadas y un control independiente del receptor para el ensayo posterior.

Finalmente, realiza una curva concentración-respuesta completa. Una evaluación de una sola concentración de un compuesto no será una medida fiable de potencia, eficacia, agonismo parcial, toxicidad o interferencia inespecífica con un ensayo.

También es necesaria la estandarización del tiempo. Una vez que recibes una señal de calcio, en pocos segundos, y luego unas horas después mides la expresión génica, no puedes simplemente comparar ambos. Las pruebas que miden el mismo receptor pueden utilizarse para medir diferentes fases de la respuesta.

Por último, validar resultados significativos utilizando un enfoque ortogonal. Si se detecta que un compuesto está activo en un ensayo de cAMP, es mejor confirmarlo con otro ensayo útil, un ensayo de unión o un control positivo específico para receptores. El Manual de Guía de Ensayos sugiere que se recomendará una validación cuidadosa, control de calidad y caracterización farmacológica de los resultados GPCR para avanzar hacia la optimización de plomos.

GPCRs para el descubrimiento de fármacos

Los GPCR siguen siendo un papel clave en el descubrimiento de fármacos, ya que están implicados en muchos aspectos de la fisiología y se expresan en superficie en la célula. GPCRdb estima que el 25% de las hormonas humanas están implicadas en respuesta a miembros de esta familia de receptores, y que aproximadamente un tercio de todos los fármacos se dirigen a los miembros de esta familia de receptores.

Para los programas tradicionales, los principales objetivos de búsqueda eran agonistas o antagonistas que se unían al sitio principal de unión de ligandos. También se están investigando moduladores alostéricos, ligandos sesgados por vías, selectividad receptor-transductores, cinética de unión y diseño de compuestos basados en estructuras.

Con la llegada de la biología estructural, esto se ha vuelto más factible. GPCRdb ahora incluye herramientas para comparar sitios de unión y estados de activación de GPCRs, incluyendo estructuras receptores determinadas experimentalmente, complejos receptor–ligando y complejos receptor–proteína G.

Un compuesto con buenas estructuras debe ser sometido a pruebas funcionales incluso si tiene buenas estructuras. Una molécula puede unirse a un objetivo adecuado con una fuerte afinidad de unión y no desencadenar la respuesta celular deseada o, alternativamente, una molécula podría activar la vía deseada, pero no de la manera correcta.

Conclusión

Los receptores acoplados a proteínas G no solo se consideran un interruptor de membrana, sino un sistema de señalización flexible.

El receptor cambia de forma en respuesta a la unión de un ligando, el receptor encuentra a sus compañeros en la célula y el entorno de la célula dicta el curso de la señal. Por eso es importante considerar la elección de los ensayos, la expresión de los receptores, el momento de la vía, los controles y la validación ortogonal.

Las mejores conclusiones para la investigación en GPCR y el descubrimiento de fármacos suelen alcanzarse como resultado de una combinación de información estructural y más de un ensayo funcional.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Cuál es la función principal de un GPCR?

Un GPCR es un receptor de la superficie celular que responde a una señal extracelular y produce una respuesta intracelular. La respuesta podría ser a través de proteínas G, arrestinas, segundos mensajeros, canales iónicos o regulación génica.

P2. ¿Todos los GPCRs se activan con la misma proteína G?

No. Diversos receptores pueden preferir activar diversas proteínas G (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 o múltiples compañeros de señalización).

P3. ¿Qué es un GPCR huérfano?

Un GPCR huérfano es un receptor para el cual el ligando activador natural no está seguro. Estos receptores siguen teniendo una gran importancia para la investigación básica y el desarrollo de fármacos.

P4. Entonces, ¿qué ensayo usar para el cribado de GPCR?

El "mejor" ensayo dependerá de la pregunta que se aborde y de la vía de señalización del receptor. Diferentes aspectos de la respuesta pueden medirse mediante cAMP, calcio, GTPγS, arrestina y ensayos biosensoriales de células vivas.

P5. ¿Cuál es la razón por la que los investigadores utilizan más de un ensayo?

Un ensayo solo puede medir una vía o tener interferencias específicas de formato. Si se puede demostrar mediante un ensayo ortogonal que el efecto observado está realmente relacionado con el receptor, entonces es posible concluir que esto es realmente un efecto del receptor.