Kits de fluorómetro: Guía práctica para la cuantificación de muestras sensibles

En los laboratorios de biología molecular, el ADN, ARN o proteína pueden medirse mediante un kit de fluorómetro que utiliza fluorescencia. Estos ensayos se basan en tintes que tienen una señal más alta cuando se unen a un objetivo específico, en lugar de medir la absorción total de los rayos UV. Esta selectividad es ventajosa si las muestras son diluidas, de bajo volumen o contaminadas con otras sustancias que puedan interferir con las mediciones de absorbancia.

Un flujo de trabajo completo suele incluir un reactivo de ensayo, un tampón de dilución, estándares, tubos o placas de ensayo, y un fluorómetro adecuado para el procedimiento. El rango del ensayo es fundamental para obtener resultados fiables, así como la consistencia de la preparación de los estándares, la protección contra la exposición inadecuada a la luz de los reactivos y todas las diluciones registradas con precisión.

Un kit de fluorómetro contiene todos los materiales y suministros necesarios para medir la fluorescencia

La mayoría de los kits de ensayo fluorómetro consisten en un tinte fluorescente altamente concentrado, un tampón de ensayo y estándares de referencia. En algunos kits también se incluyen tubos, tarjetas de protocolo o ajustes específicos de ensayo para instrumentos.

La química del colorante será el factor determinante para medir el ensayo. La cuantificación selectiva de ADNdsDNA debe realizarse en un kit de ADN de doble cadena. Los ensayos de ARN, ADN monocatenario y proteínas se basan en diferentes químicas de unión y no son intercambiables.

Un ejemplo es que los kits comerciales para dsDNA pueden incluir un reactivo concentrado para ensayos, un tampón diluyente y estándares de ADN prediluidos. Existen otros sistemas que suministran reactivos compatibles con fluorómetros de tubo único o microplacas con las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas.

A veces, la fluorescencia es mejor que la absorbancia UV

La estimación de la concentración de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría UV se basa en la absorbancia a 260 nm. Es rápida y útil para proporcionar proporciones de pureza, pero sales, nucleótidos libres, proteínas, ARN, ADN y otros compuestos orgánicos pueden provocar una señal de absorbancia.

Los ensayos fluorescentes se crean para ser más específicos para un analito seleccionado. Esto puede ser útil para mejorar la precisión de una baja concentración o muestra que pueda contener contaminantes potenciales. Por tanto, la cuantificación fluorométrica puede ser más sensible y selectiva que la absorbancia UV para la medición de ADN, ARN o proteína específica.

Ambos métodos pueden usarse en combinación. La fluorescencia puede usarse para medir la concentración de un objetivo dado y la absorbancia UV puede proporcionar una medición de pureza más general.

Elige el kit para el analito y el rango de medición.

Existen varios tipos de kits de fluorómetros comunes, como:

• Ensayos de ADNDd de alta sensibilidad
• Ensayos de ADNDd de amplio alcance
• Ensayos de ARN
• Ensayos de ADN
• Ensayos de proteínas
• Ensayos de calidad de ARN

Extractos de baja concentración y bibliotecas de secuenciación preparadas pueden detectarse mediante un ensayo de alta sensibilidad. Los ensayos de rango estrecho son mejores para muestras de alta concentración. Las muestras fuera del rango validado deberán diluirse o los resultados pueden ser menos fiables.

Los rangos de cuantificación entre los kits de alta sensibilidad y de amplio alcance pueden ser diferentes y corresponder al mismo analito. Por tanto, el ensayo debe elegirse en función de la concentración esperada, y no solo en función del nombre de la muestra.

El kit también debe ser compatible con el fluorómetro. Verifica los canales de excitación y emisión, el formato del tubo/placa, el volumen de la muestra, el método de calibración y las opciones de ensayo programadas. Se pueden preprogramar protocolos específicos en algunos fluorómetros para análisis de ADND, ARN y ADNss, y otros pueden programarse a medida.

Escribe las definiciones para el Volumen y el Rendimiento de Muestra

Un volumen pequeño es útil si las muestras son difíciles de obtener o requieren preservación para experimentos posteriores. Se requieren unos pocos microlitros de muestra en algunos sistemas fluorométricos de laboratorio, pero normalmente la muestra se coloca en un volumen mayor de solución de trabajo.

El rendimiento también es un factor importante. Para mediciones ocasionales y pequeños lotes, un fluorómetro de tubo único puede ser adecuado. Un instrumento o un flujo de trabajo de microplacas que pueda procesar múltiples muestras de extracción o múltiples bibliotecas de secuenciación puede ser preferido para laboratorios con muchas muestras.

No todos los instrumentos son los más prácticos. Un buen sistema debe minimizar el pipeteo repetitivo, facilitar la preparación regular y igualar la cantidad real de muestras que el laboratorio manejará de forma habitual.

Seguir un flujo de trabajo consistente de ensayo

A continuación se presenta un protocolo estándar para kits de fluorómetro:

• A. La solución funcional está preparada. Se crea una solución funcional.
• Establecer los estándares necesarios
• Sumando cada muestra desconocida
• Mezclando a fondo samples y estándares
• Incubación durante el tiempo especificado
• Prevención de reacciones por exposición inapropiada a la luz
• Usando una regla para medir el ancho y la longitud del cerebro.9. Medición correcta del cerebro usando una regla.
• Aplicación de factores de dilución de muestras

Utiliza pipetas calibradas para preparar y utiliza estándares y muestras de la misma manera. Si un paso de pipeteo se realiza con bajo volumen, un pequeño error en el volumen puede marcar una diferencia significativa en la concentración final.

El tiempo necesario para la incubación también es importante. Tomar una muestra al principio y otra sustancialmente más tarde puede causar variaciones innecesarias. Algunos ensayos también son sensibles a la diferencia de temperatura entre los estándares y las muestras.

Utiliza estándares, blanks y réplicas adecuadamente

Se utilizan estándares para relacionar la cantidad de analito con la intensidad de fluorescencia. Deben mezclarse bien, etiquetarse correctamente y mantenerse alejados de la contaminación.

Cuando se inserta una muestra desconocida en un espacio en blanco, la señal medida se debe al reactivo, al buffer, al tubo o a la matriz de la muestra de fondo. Las mediciones replicadas son útiles si la muestra es valiosa, la concentración exacta está cerca del límite del ensayo o un resultado inesperado afectaría a un proceso costoso aguas abajo.

Si hay lecturas duplicadas que discrepan, no calcules simplemente un promedio de las dos lecturas. Verifica la precisión del pipeteo, la mezcla de muestras, la presencia de burbujas, la limpieza del tubo, el tiempo de incubación, la temperatura y el rango de medición elegido.

Hombres y mujeres tienen diferentes formas de medir el dolor

Algunas de las razones comunes de la falta de fiabilidad en resultados fluorométricos son:

• La selección del ensayo equivocado para el objetivo
• Selección de un rango de sensibilidad inadecuado
• No usar el recipiente correcto para almacenamiento y preparación
• Añadir volúmenes de muestra inconsistentes
• La presencia de contaminantes en los estándares o en la solución de trabajo.
• La trampa para dejar burbujas en la trayectoria óptica.
• Está prohibido el uso de tubos rayados o incompatibles. No se permiten tubos rayados o incompatibles.
• Exposición excesiva a reactivos fotosensibles
• No consideres que el número de celdas en una muestra se reduce por dilución.
• Uso del dispositivo fuera del alcance del dispositivo validado.

Las muestras concentradas también pueden contaminar pipetas o áreas de trabajo, y afectar a futuras muestras de baja concentración. Esto se minimiza con consejos nuevos, superficies de trabajo limpias y una secuencia de muestras racional.

Conecta la medición con el flujo de trabajo aguas abajo arrastrándola al flujo de trabajo aguas abajo

Los kits de fluorómetros se emplean frecuentemente antes de PCR, qPCR, clonación, preparación de bibliotecas de secuenciación, electroforesis, transfección y otros flujos de trabajo que implican una entrada controlada de muestras.

La cuantificación es importante para normalizar muestras, comparar el rendimiento de extracción y obtener una entrada de reacción consistente. Los ensayos de ARN (basados en fluorescencia) se aplican antes de otras aplicaciones como RT-PCR y la preparación de la cDNA-library; La cuantificación del ADN se aplica en diversas aplicaciones posteriores como PCR, clonación, transfección y secuenciación de nueva generación.

Por tanto, la elección del kit debe estar orientada a la decisión tomada tras la medición. Se podía usar un ensayo de amplio rango durante una revisión rutinaria de extracción, y otro más sensible para trabajos de secuenciación de baja entrada.

Siempre mantén y maneja los reactivos adecuadamente

Los reactivos fluorescentes pueden ser sensibles a la luz, la temperatura y el manejo. Guárdala, calienta, mezcla y caduca según las instrucciones del kit. No todos los tintes fluorescentes pueden congelarse, almacenarse a temperatura ambiente o exponerse a la luz del laboratorio.

Marca claramente las soluciones que funcionan y recuerda registrar la fecha en que se fabricaron. Antes de sospechar que las muestras originales han cambiado, comprueba la antigüedad del reactivo, historial de almacenamiento de reactivos, estándares, pipetas, ajuste del instrumento, temperatura y compatibilidad con el tubo.

Conclusión

Los kits de fluorómetro son sensibles y selectivos para detectar la cuantificación de ADN, ARN o proteína, especialmente en muestras valiosas o diluidas. Una medición fiable requiere que el ensayo sea adecuado para el analito y el rango de concentración, el uso de un fluorómetro adecuado, la preparación constante de estándares y el control de todo el proceso.

No es el kit con el límite de detección más bajo que indica el mejor equipo. Es esa que se ajusta al tipo de muestra, el rendimiento, la aplicación posterior y los requisitos de control de calidad del laboratorio.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Cuáles son las aplicaciones del Kit de Fluorómetro?

Existen varios kits diferentes disponibles para pruebas de calidad de ADND, ADNs, ARN y algunas pruebas de ARN. La química del método utilizado para el cribado debe ser adecuada para el objetivo.

P2. ¿Cuáles son más efectivos, los kits de fluorómetros o los métodos UV?

Tienden a ser más específicos y sensibles a un analito en particular. La absorbancia UV puede considerarse válida para la prueba de pureza semifinal y para medir la pureza general de la muestra.

P3. ¿Cuánta muestra necesitas?

¡Los volúmenes varían según el ensayo y el instrumento! De hecho, existen muchos sistemas de mesa disponibles, que requieren solo un par de microlitros de la muestra original.

P4. ¿Cuál es el reactivo utilizado para analizar el ARN de ADN?

Normalmente no de forma selectiva. En la aplicación rutinaria, puede querer medir el contenido de ADN y/o ARN, por lo que un ensayo puede ser específico para uno o ambos.

P5. ¿Cuál es la causa de la variación en los resultados de diferentes réplicas?

Estos suelen ser causados por un error de pipeteo, mezcla inadecuada, burbujas, contaminación, temperatura o error en el rango de medición.