Disruptor ultrasónico programable: Construcción de un flujo de trabajo de sonicación repetible

Cuando el laboratorio requiere más control del que ofrece un homogeneizador portátil, un disruptor ultrasónico programable podría ser la solución. Puede alterar células, dispersar partículas, homogeneizar suspensiones, cortar ácidos nucleicos o preparar muestras para análisis posteriores.

El instrumento es fácil de usar. El reto es encontrar condiciones que procesen la muestra correctamente sin que se produzca daño al material que el laboratorio quiere recuperar, y sin sobrecalentamiento de la muestra.

Aquí es donde el control programable resulta útil. El operador puede ajustar la amplitud y/o el tiempo de procesamiento, el ciclo de pulsos, la temperatura límite o la energía total sin mantener pulsado un botón y sin juzgar el resultado por el sonido. Una vez establecido un método optimizado, las condiciones optimizadas pueden repetirse para muestras posteriores.

Cómo funciona la interrupción ultrasónica

El disruptor ultrasónico es un aparato que transforma la energía eléctrica en vibración mecánica. Esa vibración se transmite a una sonda que el convertidor coloca en la muestra líquida.

Cuando la sonda se mueve a gran velocidad en el líquido, se generan cambios de presión que provocan la formación de burbujas microscópicas de líquido. Estas burbujas crecen y se contraen y se denominan cavitación. Las fuerzas generadas en la zona local pueden causar la ruptura de las membranas celulares, la ruptura de agregados y permitir una mejor mezcla o dispersión.

En términos de uso práctico, la sonda está generando una enorme cantidad de energía mecánica en una zona pequeña. Por eso la sonicación con la sonda puede ser rápida, pero también puede ser perjudicial para un objetivo sensible o causar espuma en un experimento.

Por qué importa el control programable

Dos muestras pueden tratarse durante el mismo tiempo, pero no recibir el mismo tratamiento.

El movimiento de la energía ultrasónica a través del líquido se verá afectado por: volumen de la muestra, viscosidad, temperatura, diámetro de la sonda, profundidad de inmersión y forma del recipiente. El instrumento programable permite al operador controlar las variables, lo cual puede estandarizarse de forma realista.

Los procesadores ultrasónicos modernos pueden tener amplitud ajustable, funcionamiento temporizado, modo de pulsos, visualización de energía, puntos de ajuste de energía y monitorización de temperatura.

Estas funciones no solo son cómodas, sino también útiles. Facilitan documentar un método y explican exactamente cómo se procesó una muestra.

El siguiente: "sonicado durante un minuto." es un método inadecuado. Debe especificar el tipo de sonda, la configuración de la amplitud, el ciclo de pulsos, el tiempo total de procesamiento, el volumen de la muestra, el método de control de temperatura y el tipo de contenedor.

Usa una amplitud inicial, no una potencia máxima

Probablemente el mayor error sea pensar que más vatios = más potencia en cada muestra.

La amplitud es una medida del movimiento de la punta de la sonda y está más directamente asociada con la intensidad de la sonicación. La potencia utilizada por el instrumento variará en función de la resistencia generada por la muestra, la sonda, la viscosidad y las condiciones de funcionamiento. Cuando un método necesita ser reproducido, es importante mantener la amplitud, temperatura, viscosidad y volumen de muestra iguales, dice Sonics.

Al desarrollar métodos, empieza con una amplitud moderada y no uses la amplitud más alta al principio. Haz una pequeña muestra de prueba, mira el resultado y solo aumenta la intensidad del proceso si es necesario.

Una sonicación excesiva podría provocar una mejor alteración de las células, pero también causar mayor temperatura, formación de espuma, desgaste de la sonda y daños en proteínas o estructuras celulares sensibles.

La amplitud adecuada depende así de la aplicación. No se debe esperar que la lisis celular y/o la dispersión de nanopartículas, la preparación de orgánulos y/o el corte del ADN sean iguales.

Controla el calor con Modo Pulso

Con sonicación continua, la temperatura de la muestra puede aumentar rápidamente. Esto es importante al utilizar proteínas, enzimas, estructuras de membranas u otros materiales sensibles a la temperatura.

Los métodos mecánicos de alteración celular pueden generar calentamiento localizado, lo que puede provocar desnaturalización o agregación de proteínas. Por tanto, la preservación de la calidad de la muestra es importante si se debe preservar la calidad de la proteína, y para ello la muestra debe mantenerse refrigerada.

El modo pulso es un ciclo entre la sonicación y la relajación. En un ciclo apagado, la muestra tiene tiempo para enfriarse y asentarse alrededor de la sonda antes de la siguiente explosión. El funcionamiento intermitente también se menciona en los manuales del equipo para ayudar a reducir la acumulación de calor y así aumentar la consistencia en el procesamiento.

El modo pulso no eliminará la necesidad de control de temperatura. Aunque los tubos son pequeños, pueden calentarse rápidamente, especialmente a grandes amplitudes. Puede que aún sea necesario usar un baño de hielo, un soporte frío, una sonda de temperatura o un corte de temperatura programado.

Asegúrate de que la sonda coincida con el volumen de muestra

Hay una influencia significativa del tipo de sonda utilizada.

Un pequeño microtip acumula energía en un pequeño elemento que puede ser de alta intensidad en un punto pequeño. Cuanta más potencia tengas, más material será grande. Como se ve en las instrucciones del fabricante, el diámetro de la sonda y el volumen real de procesamiento están altamente correlacionados, pero el rango final de valores depende del proceso.

Una sonda demasiado grande para una muestra pequeña puede salpicar y/o sobrecalentarse. Una punta pequeña en un recipiente grande podría causar un procesamiento desigual y tener un tiempo de procesamiento innecesariamente largo.

La sonda debe ser lo suficientemente profunda para transferir energía eficientemente al líquido, pero no tan profunda como para succionar demasiado aire dentro de la muestra líquida. Durante la vibración, no debe entrar en contacto con el fondo ni con el lateral del recipiente.

La forma de los recipientes también es importante. Si se utiliza un recipiente estrecho para enfocar energía, puede enfocar la energía de forma diferente a un vaso ancho y usar un tubo o recipiente diferente en el mismo estudio puede cambiar el resultado, incluso si los ajustes del instrumento son los mismos.

Construye el método alrededor de la muestra – CSTA 2014, Sección 2, Grado 12, Sección B, Tarea 3

Normalmente, tras unas breves pruebas se encuentra un método sonable para la sonicación.

Comienza con el tipo real de muestra, el tamaño de la muestra, concentración, tampón y contenedor destinados a usarse para análisis rutinarios. Hay que mantener la muestra fría; Selecciona una sonda adecuada. Utiliza pulsos de amplitud media y breves.

Revisa el resultado de cada ensayo utilizando un método que simule el objetivo real. Esto puede ser microscopía, rendimiento de proteínas, actividad enzimática, viscosidad y/o clarificación tras la centrifugación. Puede incluir la medición del tamaño de las partículas y/o la estabilidad visual para su dispersión.

No evalúes el éxito en función del nivel de turbidez o claridad de la muestra. La pérdida de actividad de la proteína objetivo pudo haberse producido antes de la aparición de la muestra.

Una vez determinadas las condiciones aceptables, documenta cuidadosamente las condiciones y repite la prueba con varias muestras independientes. No hay mejor manera de comprobar la fiabilidad de un método que dejarlo repetirse.

Materiales comunes utilizados en el laboratorio

Este tipo de disruptores ultrasónicos programables se adopta ampliamente en los siguientes campos:

• La alteración de la pared celular de bacterias y mamíferos. La ruptura de las paredes celulares bacterianas y mamíferas.
• El corte preliminar de los tejidos debe ser seguido por la homogeneización tisular. Los tejidos deben homogeneizarse tras el corte preliminar.
• Esto abarca los procedimientos necesarios para preparar muestras de proteínas y ácidos nucleicos. La preparación de muestras de proteínas y ácidos nucleicos.
• Cizallamiento de cromatina por ADN o cizallamiento de cromatina. Cizallamiento de ADN o cromatina.
• Una dispersión de partículas y nanopartículas.
• Emulsificación
• Desaglomeración
• Extracción y mezcla
• Dificultad para preparar suspensiones. Dificultad para hacer suspensiones difíciles.

Existen varios métodos físicos diferentes que pueden utilizarse para la lisis celular, como la sonicación. El enfoque más adecuado variará según el tipo de célula, el tamaño de la muestra, la aplicación posterior y la sensibilidad del material a extraer.

Si una técnica de procesamiento de baja intensidad u otra técnica de interrupción es más adecuada para orgánulos delicados o proteínas fácilmente destruidas, utiliza esa técnica.

Hay problemas de funcionamiento comunes que deberías evitar

La espuma suele ser causada por que la sonda está demasiado cerca de la superficie del líquido y/o la muestra se procesa con demasiada intensidad. Un ligero descenso de la sonda, una disminución de amplitud o un cambio en el ciclo del pulso pueden ser útiles.

Las razones de la mala interrupción son que la amplitud es demasiado baja, se utiliza la sonda equivocada, se usa demasiada muestra, la muestra no está sumergida a la profundidad adecuada o es demasiado corta en el tiempo total de procesamiento.

A veces se modifican varias variables para que los resultados sean inconsistentes. El método puede variar en función del tubo utilizado, la temperatura inicial de la muestra, la viscosidad, la profundidad de penetración de la sonda en la muestra y el volumen.

Cuando se oye un ruido mecánico o es extraño, no debe ignorarse. Puede ser señal de sonda floja, punta dañada o un mal ensamblaje. El instrumento debe detenerse y comprobarse antes de realizar un procesamiento adicional.

Las puntas de las sondas también se erosionan por erosión por cavitación. Si la superficie se daña, se efectuará la transferencia de energía y se podrán introducir partículas metálicas en la muestra. Revisa la sonda con frecuencia y cámbiala según las instrucciones del fabricante.

Trabajar con seguridad

Usa un soporte y una abrazadera adecuados para asegurar el convertidor, no hagas un conjunto inestable.

Sin embargo, los procesadores de ultrasonidos emitirán un sonido audible y las directrices del fabricante sugieren protección auditiva cuando se usen. Un terrario acústico reducirá la exposición y, además, contendrá salpicaduras o aerosoles.

Manipular y contener correctamente el material biológico y seguir los procedimientos de seguridad del laboratorio. Se debe controlar la profundidad de la sonda para minimizar la formación de aerosoles y la formación de espuma. Enjuaga entre muestras y descontamina la sonda mediante un procedimiento de enjuague adecuado que sea eficaz tanto para la sonda como para la muestra.

Conclusión

El resultado se ve afectado por la amplitud, el ciclo de pulsos, el tamaño de la sonda, el volumen de la muestra, la temperatura, la profundidad de la muestra dentro del recipiente y la forma del recipiente. El ritmo más duro no es un buen punto de partida.

Un flujo de trabajo fiable comienza con ensayos breves y bien controlados, luego pasa a una prueba posterior adecuada para evaluar el resultado, y después se recoge suficiente información para que pueda ser repetida por otro operador.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Para qué se usa el disruptor ultrasónico programable?

Para lisis celular, homogeneización, dispersión de partículas, cizallamiento de ADN, emulsión, extracción y diversas aplicaciones para procesamiento de líquidos.

P2. ¿Mejor amplitud más alta?

No. Un aumento en la amplitud incrementará la intensidad de la sonicación, aunque puede resultar en un aumento del calentamiento, la espuma, el desgaste de la sonda y daños en la muestra.

P3. ¿Por qué se utiliza el Modo Pulso?

Modo pulso: Periodos de reposo entre las ráfagas ultrasónicas. Esto ayudará a reducir la acumulación de calor y devolverá el material a la sonda.

P4. ¿Cuál es el tamaño óptimo de la sonda?

El volumen, tamaño del recipiente de muestra e intensidad del procesamiento requerido deben ser igualados por la sonda. Las puntas pequeñas son buenas para volúmenes pequeños y las sondas grandes para volúmenes grandes.

P5. ¿Cómo hacer que los resultados de la sonicación sean reproducibles?

Sonda, amplitud, ciclo de pulsos, volumen, temperatura, profundidad de inmersión, composición de la muestra.