Transiluminador UV: Elegir y Utilizar el Sistema Adecuado para la Visualización de Gel

el resultado es problemático con un transiluminador UV. Lee el ADN, ARN o bandas proteicas de forma sencilla, pasando luz ultravioleta a través de un gel teñido. El operador puede entonces examinar el gel, hacerle una foto o recortar la banda deseada para trabajar con él más adelante.

La mayoría de los problemas están relacionados con otros temas que no sean el interruptor de encendido. Estas se deben a una longitud de onda incorrecta, iluminación y tinte incompatibles, exposición demasiado larga y falta de protección UV.

Un buen flujo de trabajo con transiluminador UV debe proporcionar bandas claras, con solo la mínima exposición a la muestra y a la persona que utiliza el instrumento.

Cómo funciona un transiluminador UV

El gel es electroforizado, dejando fragmentos moleculares que normalmente no son visibles a simple vista. Un tinte fluorescente que se adhiere o interactúa con el material a teñir. El gel teñido se transfiere entonces a la superficie iluminada y el tinte se excita por la luz ultravioleta, emitiendo una fluorescencia visible a simple vista.

El fondo oscuro y las bandas brillantes permiten aproximar el tamaño de los fragmentos, comparar la intensidad de las muestras, comprobar productos de amplificación o encontrar material para la extracción en gel.

Existen varios transiluminadores UV disponibles en longitudes de onda estándar de 254, 302 y 365 nm. Algunos ofrecen una sola longitud de onda, otros dos o tres; cuál es mejor depende del tipo de instrumento y de la longitud de onda deseada. Las aplicaciones de visualización en gel y electroforesis utilizan una amplia gama de radiación UV cerca de 302 nm.

Selecciona la longitud de onda para la aplicación real

La intensidad de la fluorescencia, el daño a la muestra y la compatibilidad de tinciones están influenciados por la selección de la longitud de onda.

A menudo se emplea una fuente de 302 nm al observar geles de ADN y ARN teñidos con fluorescente, ya que generalmente produce una señal de alta intensidad y muchas tinciones conocidas de ácidos nucleicos pueden usarse con esta fuente. Una solución sencilla para revisiones rutinarias de gel y documentación.

Si la reducción del daño al ADN inducido por UV es más importante que la señal más fuerte posible, puede considerarse usar UV de onda larga, que está cerca de 365 nm. Thermo Fisher recomienda minimizar la exposición al ADN y sugiere usar una longitud de onda más larga (alrededor de 360 nm) si se recupera ADN del gel.

El uso de UV de onda corta (cerca de 254 nm) para la visualización rutinaria de geles de ADN no debe considerarse automático, aunque existen algunos transiluminadores de laboratorio. Es adecuado para su uso dependiendo del material fluorescente y de su aplicación en laboratorio.

Por tanto, la mayor longitud de onda no es la opción más eficaz. Es la que se adapta a la tinción y mantiene la muestra lo suficiente para el siguiente paso.

Usa un tinte de gel de otro color para una fuente de luz de otro color

Un transiluminador y un tinte en gel deben considerarse como un sistema óptico único.

Existen diferentes tipos de tintes con distintas características de excitación y emisión. Una tinte puede tener una alta reflectividad UV y baja reflectividad de luz azul, y viceversa. El filtro de cámara también debe permitir el paso de la fluorescencia emitida y evitar el paso de radiación de excitación no deseada.

Antes de un nuevo ensayo:

• Las longitudes de onda que excitan la tinción son lequel. Las longitudes de onda que excitan la mancha son 'luequels'.
• La decisión de usar o no un filtro fotográfico la determinará cada fotógrafo.
• Los atributos de la sustancia tintora (ADN, ARN o proteína)
• Si el gel se va a cortar o no, ¿cómo se documentará?
• Si la fuente de luz es una tecnología nueva, ¿existe algún método para capturarla usando el sistema de imagen actual?

Por ejemplo, los geles tintidos seguros para SYBR pueden ser fotografiados utilizando equipos de fluorescencia adecuados con filtro de luz UV o azul; un filtro usado para la imagen de bromuro de etidio puede no ser adecuado.

Si una imagen es demasiado tenue, no significa necesariamente que haya muy poco ADN en el gel. La causa puede ser una longitud de onda de excitación inadecuada, un filtro de cámara incorrecto, el uso de lámparas UV obsoletas o demasiada luz en la habitación.

Si se va a recuperar el daño al ADN, limita la exposición a los rayos UV

Los ácidos nucleicos son susceptibles a daños causados por la luz ultravioleta. Esto es significativo si un investigador desea extraer una banda de ADN del gel y utilizar el ADN restante en una aplicación posterior como clonación, ligación, secuenciación u otras aplicaciones.

La exposición prolongada puede provocar el corte del ADN así como otros daños, lo que puede afectar la calidad del ADN recuperado. La exposición prolongada a la radiación UV puede causar daños al ADN que podrían afectar a aplicaciones posteriores como la subclonación, señala Thermo Fisher.

En caso de que se requiera visualización UV:

1. Coloca herramientas de corte y tubo de recogida antes de encender la luz.
   1. Ajusta la configuración más baja que dará una banda clara.
   1. La exposición debe mantenerse al mínimo.
   1. Si es posible, piensa en una longitud de onda más larga para la luz ultravioleta.
   1. No veas repetidamente el mismo gel.
   1. Toma nota de la banda elegida y apaga la fuente.

Un transiluminador de luz azul compatible para clonación puede ser más adecuado para trabajos de clonación especialmente sensibles. Los colores pueden excitarse con la luz azul, y se ha encontrado menos daño al ADN causado por la luz azul.

Comprobar la uniformidad de la iluminación

El transiluminador debe proporcionar una iluminación uniforme del área a observar.

Si un lado de la superficie es más intenso que el otro, las bandas idénticas tendrán intensidades variables dependiendo de su ubicación en el gel. Esto es especialmente relevante cuando se comparan las líneas en el mismo laboratorio y/o cuando se emplea una imagen para análisis semicuantitativo.

La uniformidad está influida por el estado de las lámparas, la disposición de las lámparas, los filtros, la limpieza de las superficies y el diseño óptico del instrumento. La iluminación uniforme es importante en el contexto de la UVP para lograr la repetibilidad de los resultados en diversas bandas y carriles.

Examina siempre el fondo para ver si es uniforme durante todo el gel, antes de depender de la intensidad de la banda. Transferir el mismo gel a otra parte de la superficie puede ayudar a desarrollar un problema de iluminación.

Utiliza el área de visualización correcta

La zona iluminada debería ser suficiente para cubrir el gel pero sin ocupar espacio extra en el banco.

Una pequeña célula es genial para los mini-geles estándar. Plataformas más grandes serán mejores para geles de gran formato, o varios geles uno al lado del otro. Existen sistemas comerciales con diferentes áreas iluminadas, normalmente de unos 20 x 20 cm o más.

Todo el gel debe quedar plano en la superficie. Es posible que se desenfoque y se desenfoquen las bandas debido a arrugas en la película protectora, demasiado buffer o una bandeja desigual.

Asegúrate de que la superficie de observación esté limpia; solo utiliza materiales y agentes de limpieza compatibles con el filtro UV. Las imágenes pueden verse afectadas por arañazos, manchas o depósitos tampones secos.

Asegúrate de proteger al usuario de la exposición a los rayos UV

Un transiluminador UV NO es una lámpara de visualización estándar, sino una fuente de luz de alta intensidad diseñada para su uso en laboratorio.

La exposición directa o indirecta a la radiación UV puede causar daños en ojos y piel. Las directrices de seguridad del laboratorio de Stanford enumeran las siguientes precauciones para el uso de un transiluminador: mantener el acceso al transiluminador bajo control cuando se esté en uso, mantener las superficies reflectantes alejadas del transiluminador y colocar señalización indicando que la piel y los ojos deben protegerse.

Utiliza siempre la tapa protectora, el escudo o el armario de imagen cerrado que se proporciona con el instrumento. Las prácticas de laboratorio que requieren trabajar con el gel pueden requerir cubrir la cara, llevar guantes, una bata de laboratorio abrochada y cubrir la piel con bloqueadores UV.

No presumas que las gafas de seguridad normales bloquean la longitud de onda UV. Llevar el equipo de protección adecuado designado para el instrumento y cumplir con las normas de seguridad contra la radiación del laboratorio.

Un mejor control de exposición se consigue con un sistema de documentación en gel cerrado con interbloqueo de seguridad, en lugar de trabajar sobre una caja de luz abierta. Algunos sistemas no permiten abrir la puerta de imagen mientras se opera en modo UV.

Los educadores deben establecer un flujo de trabajo consistente para ver

Hay una pista sencilla que se puede usar para minimizar la variabilidad innecesaria:

• Electroforesis y tinción 1. Electroforesis y 1 tinción.
• Asegúrate de que el tinte tenga la longitud de onda correcta.
• Asegúrate de que el exterior de la bandeja de gel esté limpio y seco.
• Elige la longitud de onda e intensidad del UV necesario.
• Aplica el gel en la zona de observación en el centro.
• Cierra el protector/recinto de imagen.
• Emplea el tiempo de exposición más corto posible para producir bandas visibles.
• Haz la foto con el filtro de emisión adecuado.
• Apaga la luz ultravioleta al mover el gel.
• Limpia la superficie después de usarla.

Si se realizan varios experimentos, la concentración de tinción debe ser la misma, al igual que el filtro de imagen, el tiempo de exposición, la intensidad y las condiciones de la cámara.

Conecta el transiluminador al flujo de trabajo de imagen

Si el usuario no necesita inspeccionar un gel, entonces se puede usar un transiluminador de mesa. Para aplicaciones más exigentes se necesita un sistema completo de documentación en gel que incluya cámara, caja oscura, filtros y software de análisis de imágenes.

Los sistemas integrados pueden utilizarse para la captura de imágenes, medición de bandas, documentación y análisis regular de gel. Bio-Rad caracteriza las plataformas de documentación en gel, que cuentan con iluminación controlada y software automático de adquisición y análisis de imágenes.

La decisión dependerá de lo que el laboratorio vaya a hacer con la imagen. En un laboratorio de investigación, el laboratorio docente puede necesitar una confirmación visual clara, un laboratorio de investigación puede necesitar archivos de imagen trazables, exposición consistente y análisis cuantitativo de bandas.

Nunca retires la fuente de luz

Aunque las lámparas UV parezcan estar encendidas, con el tiempo comienzan a perder su potencia. Con una intensidad reducida, el operador aumentará el tiempo de exposición, lo que podría llevar a una menor consistencia y a una mayor exposición de la muestra.

Sigue las directrices de mantenimiento de lámparas del fabricante. Un radiómetro UV sería una medida más objetiva que la estimación visual y la UVP ha determinado que la medición de irradiancia es un método adecuado para monitorizar la vida útil de una fuente UV.

Cambia las lámparas como un juego si se recomienda, limpia a fondo el filtro de visualización y anota las fechas de mantenimiento. Las lámparas UV fluorescentes también pueden contener mercurio y deben ser tratadas y eliminadas como residuos peligrosos según los requisitos locales.

Conclusión

Al usar un transiluminador UV para la visualización en gel, puede hacerlo rápida y claramente, pero no puede ser solo brillante en luz ultravioleta para obtener buenos resultados.

La longitud de onda debe ser adecuada para el tinte y los usos aguas abajo. La iluminación debe ser lo más uniforme posible, la exposición lo más corta posible, el filtro de la cámara debe ser igual que la fluorescencia emitida y el usuario debe estar protegido de la exposición UV de la fuente de luz.

El instrumento adecuado es aquel que se adapte al tamaño del gel, un método de tinción, los requisitos de imagen, el flujo de trabajo para la recuperación de las muestras y los controles de seguridad para el entorno del laboratorio.

Preguntas frecuentes

P1. ¿Para qué se usa un transiluminador UV?

Se utiliza principalmente para visualizar bandas de ADN, ARN o proteína marcados con fluorescencia teñidos en geles de electroforesis. También puede incorporarse a un sistema de documentación en gel.

P2. ¿Cuál de las siguientes longitudes de onda se utiliza comúnmente para los geles de ADN?

Un uso común de la radiación ultravioleta de rango medio (cerca de 302 nm) es para la visualización rutinaria de los geles. La selección final debe ser similar a la del tinte, así como a la aplicación aguas abajo.

P3. ¿La luz UV muta el ADN?

Sí. La exposición prolongada puede causar daños en el ADN y disminuir la clonabilidad del ADN y las aplicaciones posteriores.

P4. ¿Cuál es más eficaz: la luz azul o la luz ultravioleta?

Si el daño UV en el usuario y/o el daño en el ADN son una preocupación, se recomienda el uso de luz azul para tintes compatibles. Incluso para algunas manchas conocidas, la radiación UV puede proporcionar mejor excitación.

P5. ¿Por qué hay una debilidad en las bandas de gel?

Esto probablemente se deba a una baja concentración de muestras, una tinción inadecuada, una longitud de onda o filtro inadecuados, lámparas envejecidas, demasiada luz de fondo o mala tinción.