Fragmentador ultrasónico de genes: Guía práctica para el cizallamiento controlado del ADN

Acortar el ADN no es el único paso que debe seguirse para preparar los ácidos nucleicos para la secuenciación. El tamaño de los fragmentos debe estar dentro de un rango útil, adecuado para las reacciones aguas abajo y con variación limitada entre muestras.

El principio de cómo funciona un fragmentador de genes ultrasónicos (más propiamente llamado fragmentador ultrasónico de ADN o ultrasonicador enfocado) es romper moléculas largas de ADN en fragmentos más cortos, utilizando energía acústica para ello. Con el control tanto de la entrega de energía como del tiempo y la temperatura, el proceso puede permitir flujos de trabajo reproducibles de NGS y cromatina sin introducir ninguna división específica de la secuencia.

Qué es un ¿Fragmentador ultrasónico de genes?

Un fragmentador genético ultrasónico es un tipo de instrumento utilizado en laboratorio para transmitir la energía ultrasónica al espécimen biológico. Las oscilaciones de presión y las fuerzas mecánicas relacionadas con la cavitación cortan el ADN en fragmentos más pequeños.

El instrumento no puede detectar ni eliminar genes concretos. La ruptura del ADN por ultrasonidos es generalmente aleatoria, no como la que consiguen enzimas de restricción o nucleasas programables. A menudo, el objetivo es una determinada distribución de fragmentos, en lugar de una secuencia nucleótidica específica.

El Ultrasonicador enfocado BoFU-100 está específicamente optimizado para el corte de ADN, ARN y cromatina, fragmentación genómica y alteración de muestras biológicas por Longlight.

¿Cómo lo dices Enfocado ¿Trabajo de ultrasonidos?

Los sondadores de sonda suministran energía a través de una sonda sumergida directamente en la muestra. El rendimiento puede variar según la profundidad de inmersión, el estado de la sonda y la técnica del operador, mientras que el contacto directo también introduce preocupaciones de limpieza y contaminación cruzada.

Un ultrasonicador focalizado es un dispositivo que enfoca la energía sonora a través de un medio de acoplamiento hacia un tubo de muestra cerrado. La muestra está sometida a energía controlada y no hay contacto directo entre la fuente acústica del instrumento y la muestra biológica.

Se utilizan parámetros de procesamiento, como el tiempo de tratamiento, la intensidad acústica, el ciclo de trabajo y la temperatura, para definir las condiciones de procesamiento. Estas variables afectan a la distribución final del fragmento y, por tanto, deben optimizarse como un método completo y no ajustarse solo sin verificación.

Por qué Temperatura ¿Es importante el control?

El tratamiento ultrasónico implica la creación de calor. Un aumento excesivo de la temperatura de la muestra puede provocar una disminución en la calidad de los ácidos nucleicos y una distribución final menos predecible de los fragmentos.

Un sistema de refrigeración integrado ayuda a mantener un entorno de procesamiento más estable. Esto es especialmente valioso trabajando con muestras de baja entrada, cromatina sensible y para múltiples ejecuciones secuenciales.

El enfriamiento no elimina la necesidad de control del método. Incluso con enfriamiento activo, el volumen de la muestra, el tipo de tubo, la temperatura de arranque y el tiempo de procesamiento deben mantenerse constantes porque influyen en la transferencia acústica de energía.

¿Cuáles son algunas de las aplicaciones de la fragmentación ultrasónica?

Una de las principales aplicaciones es la preparación de la biblioteca NGS. La reparación de extremos, la ligación de adaptadores, la amplificación u otros pasos para construir la biblioteca se realizan sobre un ADN genómico fragmentado. El rango de tamaño deseado variará según la plataforma de secuenciación y el protocolo utilizado para la biblioteca.

También se requiere sonicación para cortar la cromatina reticulada en los procesos de inmunoprecipitación de cromatina. La intención es generar fragmentos, que puedan ser inmunoprecipitados, que contengan interacciones relevantes ADN-proteína.

Otras aplicaciones pueden ser para fragmentación de ARN, procesamiento de muestras de FFPE, para la alteración celular y tisular y flujos de trabajo de extracción. Longlight's Soluciones de aplicación genómica incluyen instrumentos NGS y productos de laboratorio.

Qué factores Control ¿el tamaño definitivo de fragmento?

El tamaño del fragmento depende de la energía acústica, el tiempo de tratamiento, el volumen de la muestra, la concentración de ácidos nucleicos y la geometría y temperatura del tubo.

Aumentar la energía acústica o el tiempo de tratamiento no produce necesariamente una disminución proporcional en el tamaño del fragmento. A medida que el ADN se acorta, la cinética de fragmentación cambia y un procesamiento excesivo puede reducir la recuperación o comprometer la calidad de la muestra.

Por tanto, un protocolo de inicio debe considerarse un punto de partida recomendado, en lugar de una configuración universal. Si se varía el tipo de muestra o se modifica el tubo o volumen de la muestra, el método debe repetirse con un sistema de análisis de fragmentos adecuado.

Cómo elegir Rendimiento?

Un solo instrumento de muestra puede ser adecuado para investigación de bajo volumen o desarrollo de métodos, o para laboratorios con métodos fluctuantes. Proporciona flexibilidad al investigador en caso de que las muestras no puedan procesarse todas de una vez.

Para laboratorios que procesan regularmente conjuntos de muestras más grandes, los sistemas multiposición pueden ser más adecuados. El Ultrasonicador multicanal enfocado BoFU-800 es capaz de procesar de 1 a 8 muestras y proporciona modos de procesamiento individuales y por lotes.

No consideres solo el número de posiciones de tubos como medida de mayor rendimiento. Otros factores que los compradores también deberían tener en cuenta son el tiempo de procesamiento, el trabajo de preparación, la gestión de los parámetros, la trazabilidad de las muestras y si todas las posiciones pueden lograr los mismos resultados de fragmentación.

Otro flujo de trabajo es el Sistema multicanal BoFU-1600, que es adecuada para requerimientos de lotes mayores.

¿Por qué existen los tubos? y ¿Es importante el volumen de muestras?

El tubo de muestra se utiliza como sistema acústico. El material del que está compuesto, el grosor de las paredes, la forma y la posición en la que se encuentra son factores que determinan cómo se entrega la energía ultrasónica al líquido.

Los parámetros del instrumento pueden no ser los mismos si se utiliza un tubo sin validación, lo que afectará al rendimiento de la fragmentación. Los tubos cerrados también minimizan la formación de aerosoles y la contaminación cruzada en el procesamiento de muestras.

El volumen de trabajo debe mantenerse dentro del volumen recomendado para el tubo seleccionado. Los volúmenes de relleno que sean demasiado bajos o inconsistentes pueden alterar el enfoque acústico y pueden reducir la repetibilidad de los resultados.

¿Cómo es un Fragmentación ¿Método validado?

El material de muestra representativo es el punto de partida para comenzar la validación del método. Utiliza los parámetros sugeridos de tubo, volumen, concentración y acústica para varias replicaciones.

Evalúa la distribución del tamaño del fragmento, los rendimientos de recuperación y el rendimiento de la biblioteca aguas abajo. Sin embargo, el tamaño medio del fragmento no es suficiente: una cola de alto peso molecular puede indicar subfragmentación, mientras que una fracción de peso molecular excesivamente bajo puede indicar sobreprocesamiento o degradación preexistente del ADN.

Una vez elegido un método, establezcan límites aceptables y documenten el programa del instrumento. Los laboratorios utilizan controles rutinarios para alertarles sobre cambios en la calidad de la muestra, consumibles o estado del instrumento.

¿Qué pasa? Compradores ¿Debería comparar entre instrumentos?

Compara los rangos de fragmentos que se pueden alcanzar, volúmenes de muestras, formatos de tubos, método de control de temperatura y número de posiciones para el procesamiento. Ten en cuenta también las necesidades de almacenamiento de protocolos, registro de registros, calibración y mantenimiento.

Solicita información de solicitud a los proveedores de una muestra similar a la tuya. Los resultados de las demostraciones deben evaluar la repetibilidad de los tubos, la repetibilidad de las posiciones y la repetibilidad de lotes de ejecuciones, no solo una prueba exitosa.

La disponibilidad de consumibles y el soporte técnico también son cruciales. Un instrumento que depende de consumibles difíciles de obtener puede provocar retrasos en el flujo de trabajo. Contacta con The Longlight Equipo de contacto para adaptar las configuraciones y consumibles BoFU a las necesidades particulares del procesamiento de muestras.

Conclusión

La aplicación más útil de un fragmentador de genes ultrasónicos es convertir el cizallamiento de ADN o cromatina en un proceso controlable y repetible. Un ultrasonicador focalizado puede hacer que el cizallamiento del ADN o la cromatina sea un proceso más controlable y reproducible cuando la entrega de energía, la temperatura, el formato del tubo y las condiciones de la muestra están correctamente estandarizados.

Es importante elegir la herramienta adecuada en relación con las muestras reales en el laboratorio y el trabajo o flujo de trabajo posterior. Una vez instalado el equipo, es importante seguir el protocolo exacto para asegurar que las bibliotecas sean consistentemente buenas.

Preguntas más frecuentes

Q1. ¿Un fragmentador genético ultrasónico corta secuencias específicas de ADN o corta el ADN de manera en gran medida independiente de la secuencia?

No, la fragmentación que ocurre con la energía ultrasónica será fragmentación mecánica aleatoria. Se necesitan enzimas o sistemas de nucleasas programables para cortar cada secuencia.

Q2. ¿Se usan los mismos ajustes para todas las muestras de ADN?

No siempre. Los cambios en el comportamiento de la fragmentación pueden producirse en función del tipo de tubos utilizados y del volumen y concentración de ADN, así como de la calidad del material inicial; deben confirmarse nuevas condiciones de muestra.

Q3. ¿Se puede hacer NGS mediante ultrasonicación enfocada?

Sí. Se utilizó popularmente para la distribución controlada de tamaños de fragmentos de ADN para la preparación de la biblioteca NGS. El rango objetivo debe ser el mismo que el protocolo seleccionado por la biblioteca.

Q4. ¿Cuál es el beneficio de los tubos de muestra cerrados?

Los tubos cerrados minimizan el contacto directo con las muestras y minimizan la formación y contaminación de aerosoles. También ofrecen una geometría controlada para permitir una transferencia regular de energía acústica.

Q5. ¿Cómo deberían hacerse controles sobre los resultados de la fragmentación?

Analizar la distribución de tamaño completo mediante un método adecuado de electroforesis o análisis de fragmentos. Estos también deben comprobarse para comprobar el rendimiento y rendimiento de la recuperación de la biblioteca posterior.